Síntese Verde de Nanopartículas de Metal e Óxido de Metal e Seu Efeito na Alga Unicelular Chlamydomonas reinhardtii

Resumo

Recentemente, a síntese verde de nanopartículas metálicas tem atraído grande atenção devido à sua viabilidade e baixíssimo impacto ambiental. Esta abordagem foi aplicada neste estudo para sintetizar materiais em nanoescala ouro (Au), platina (Pt), paládio (Pd), prata (Ag) e óxido de cobre (CuO) em meio aquoso simples usando goma de polímero natural karaya como redutor e agente estabilizador. O potencial zeta, a estabilidade e o tamanho das nanopartículas (NPs) foram caracterizados por Zetasizer Nano, espectroscopia UV-Vis e microscopia eletrônica. Além disso, o efeito biológico dos NPs (faixa de concentração de 1,0–20,0 mg / L) em uma alga verde unicelular ( Chlamydomonas reinhardtii ) foi investigado avaliando o crescimento de algas, integridade da membrana, estresse oxidativo, clorofila ( Chl ) fluorescência e eficiência fotossintética do fotossistema II. As NPs resultantes tinham um tamanho médio de 42 (Au), 12 (Pt), 1,5 (Pd), 5 (Ag) e 180 (CuO) nm e mostraram alta estabilidade ao longo de 6 meses. Em concentrações de 5 mg / L, os NPs de Au e Pt reduziram apenas ligeiramente o crescimento das algas, enquanto os NPs de Pd, Ag e CuO inibiram completamente o crescimento. Os NPs de Ag, Pd e CuO mostraram fortes propriedades biocidas e podem ser usados ​​para prevenção de algas em piscinas (CuO) ou em outras aplicações antimicrobianas (Pd, Ag), enquanto Au e Pt não possuem essas propriedades e podem ser classificados como inofensivos para algas verdes .

Histórico

Nanopartículas de metal e óxido de metal (NPs) têm recebido atenção substancial da pesquisa devido às suas excepcionais propriedades elétricas, ópticas, magnéticas e catalíticas. Estes têm permitido seu amplo uso em diversas aplicações industriais, médicas, agrícolas e ambientais, com outros usos constantemente em desenvolvimento [1,2,3,4]. Os métodos de síntese tradicionais para NPs de metal e óxido de metal cristalinos incluem a redução e a estabilização de agentes químicos que são tóxicos para humanos e outras espécies em diferentes níveis tróficos [5,6,7,8,9,10,11]. Em resposta, os pesquisadores estão agora procurando abordagens alternativas de “síntese verde” em um esforço para reduzir ou eliminar produtos químicos prejudiciais durante a produção de NPs [12,13,14,15,16,17,18].

Muitos estudos têm relatado sobre a ampla gama de aplicações de NPs de metais e óxidos metálicos, devido às suas propriedades físico-químicas únicas e abrangentes [19]. NPs de prata (Ag), por exemplo, são amplamente usados ​​para aplicações médicas, têxteis, embalagens de alimentos e tratamento de água [20,21,22,23]. NPs de ouro (Au) têm sido empregados em pesquisas biomédicas, enquanto NPs de platina (Pt) são amplamente utilizados para aplicações industriais devido às suas propriedades catalíticas [24, 25]. Finalmente, os NPs de paládio (Pd) têm sido usados ​​como catalisadores durante a fabricação de produtos farmacêuticos [26, 27] e os NPs de óxido de cobre (CuO) como agentes anti-incrustantes em tintas e tecidos devido às suas propriedades antibacterianas comprovadas [28]. NPs de metal podem servir como catalisadores para degradar uma ampla variedade de contaminantes ambientais comuns, incluindo bifenilos policlorados (PCBs), alifáticos halogenados, pesticidas organoclorados, metais tóxicos e solventes orgânicos halogenados [29]. CuO, Ag e Au NPs também são usados ​​para detectar gases tóxicos, como monóxido de carbono (CO), cianeto de hidrogênio (HCN) e dióxido de enxofre (SO ₂ ) [30, 31]. Recentemente, vários NPs de metal (Au, Ag e Cu) que exibem ressonância plasmônica de superfície localizada têm sido usados ​​no desenvolvimento de bionanosensores [24].

Infelizmente, NPs de metal e óxido de metal têm o potencial de impactar negativamente a saúde humana e o meio ambiente em geral, por ex. pela geração de novas classes de toxinas que podem afetar adversamente as comunidades microbianas, com efeitos em cadeia para todo o ecossistema [32,33,34,35]. Como resultado, os efeitos dos NPs nos microrganismos têm sido amplamente estudados. Ag NPs, por exemplo, mostraram inibir o crescimento de algas e a fotossíntese, alterando a clorofila ( Chl ) conteúdo de fluorescência de Chlamydomonas reinhardtii [36], alterando o crescimento celular de Thalassiosira pseudonana e Synechococcus sp. [37] e afetando o crescimento e a viabilidade celular na planta aquática lentilha-d'água inchada Lemna gibba [38] . Książyk et al. [39] e Sørensen et al. [40] relataram Pt NPs como inibindo o crescimento nas microalgas de água doce Pseudokirchneriella subcapitata [39, 40]. Sem surpresa, tanto os NPs de Ag quanto de Pd foram aplicados como agentes antibacterianos úteis contra uma variedade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas [41,42,43]. Em contraste, pensa-se que Au NPs não têm um impacto negativo sobre bactérias ou algas [44, 45], embora um estudo tenha mostrado que eles podem ser tóxicos, dependendo de sua carga e química de superfície [46]. Impactos negativos foram relatados para NPs de CuO em C. reinhardtii [36, 47], P. subcapitata [48], alga marinha ocidental Elodea nuttallii [49] lentilha-d'água Lemna sp . , Daphnia magna [48] ​​e os primeiros estágios da vida do peixe-zebra Danio rerio [50, 51].

Os NPs de metal possuem propriedades físicas e químicas que podem causar danos às células, e. através da geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (ROS) com subsequente dano ao DNA, proteínas e lipídios. A formação de ROS por Ag NPs foi detectada em Chlorella vulgaris e Dunaliella tertiolecta culturas e em L. gibba [52], bem como em bactérias [53]. Os NPs de CuO e Fe são capazes de gerar radicais de hidrogênio, uma família de ROS produzida por meio da reação de Fenton, que pode prejudicar uma variedade de organismos aquáticos e terrestres [54, 55].

A química verde é um conjunto de princípios ou práticas que incentivam o design de produtos e processos que reduzem ou eliminam o uso e a geração de substâncias perigosas [56,57,58]. As práticas atuais de nanotecnologia verde freqüentemente envolvem o uso de fontes naturais, solventes não perigosos, materiais biodegradáveis ​​e biocompatíveis e processos de eficiência energética na preparação de NPs [59]. Como exemplo, biopolímeros, como celulose, quitosana, dextrana ou gomas de árvore, são frequentemente usados ​​como agentes redutores e estabilizadores para a síntese de NP de metal [12, 60,61,62]. A goma karaya (GK) usada neste estudo é uma goma de árvore natural de Sterculia consistindo em aproximadamente 13–26% de galactose e 15–30% de ramnose, 30–43% de ácido galacturônico, 37% de resíduos de ácido urônico e cerca de 8% de grupos acetil [63]. Estudos toxicológicos comprovaram o GK como atóxico, permitindo seu uso até mesmo como aditivo alimentar [62,63,64,65].

Neste estudo, objetivamos usar uma abordagem de química verde para preparar uma série de NPs de metal (Ag, Au, Pt, Pd) e óxido de metal (CuO) usando soluções aquosas de um polímero natural, GK. O efeito biológico desses NPs recém-preparados foi investigado em C. reinhardtii usando uma gama de respostas celulares, incluindo crescimento de algas, estresse oxidativo, danos à membrana, Chl fluorescência e fotossíntese. Estabilidade de NP, tamanho e potencial zeta foram determinados em meio de crescimento de algas, juntamente com solubilidade e testes abióticos de geração de ROS.

Métodos

Materiais

GK comercial, nitrato de prata (AgNO ₃ ), tetracloroaurato de hidrogênio (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), cloreto de cobre (CuCl ₂ · 2H ₂ O), ácido cloroplatínico (H ₂ PtCl ₆ ), tetracloropaladato de potássio (II) (K ₂ PdCl ₄ ), cloreto de hidrogênio (HCl), hidróxido de sódio (NaOH) e hidróxido de amônio (NH ₄ OH) foram todos adquiridos da Sigma-Aldrich, EUA. Água desionizada (DI) foi usada para todos os experimentos. Todos os produtos químicos e reagentes usados ​​neste estudo eram de grau analítico.

O C. reinhardtii cultura de algas (cepa CPCC11) foi obtida do Canadian Phycological Culture Centre (CPCC, Departamento de Biologia, University of Waterloo, Canadá).

Processamento GK

Pó de GK (1 g) foi introduzido em um béquer de vidro contendo 1 L de água DI e suavemente agitado durante a noite em um agitador magnético. A solução de goma foi subsequentemente deixada à temperatura ambiente (20 ° C) durante 18 h para separar qualquer matéria não dissolvida. A solução de goma foi então filtrada através de um funil de vidro sinterizado (tamanho de poro de 10-16 μm) e a solução límpida liofilizada e armazenada até ser necessária.

Síntese de NPs de metal e óxido de metal usando GK

Resumidamente, alíquotas de 100 μL de 10 mM AgNO ₃ , HAuCl ₄ , H ₂ PtCl ₆ e K ₂ PdCl ₄ soluções foram adicionadas a 10 mL de solução aquosa de GK em frascos cônicos de 50 mL separados. O pH da dispersão coloidal foi ajustado pela adição de 0,1 N de HCl ou 0,1 N de NaOH a fim de atingir o rendimento máximo de formação de NP. Para sintetizar os NPs Ag, Au, Pt e Pd, o AgNO ₃ , HAuCl ₄ , H ₂ PtCl ₆ , e K ₂ PdCl ₄ e as misturas GK foram agitadas em um agitador orbital Innova 43 (New Brunswick Scientific, EUA) a 250 rpm em temperaturas variando de 45 a 95 ° C por 1 h. As soluções tornaram-se amarelo claro, vermelho vinho, preto intenso e preto neutro, respectivamente, indicando a formação de Ag, Au, Pt e Pd NPs. No caso do Pt, a redução e a formação de NP ocorreram em pH 8,0 e temperatura de 90 ° C, enquanto Pd NPs foram formados em pH 8,5 e 95 ° C. Veja mais em Padil et al. [66, 67].

NPs de CuO foram sintetizados usando um processo de síntese térmica coloidal [13]. Resumidamente, alíquotas de 100 μL de uma solução 10 mM de cloreto de cobre di-hidratado (CuCl ₂ · 2H ₂ O) foi misturado com 10 mL da solução GK (100 mg dispersos em 10 mL de água DI) e NaOH em balões cônicos de 50 mL separados, com CuCl ₂ · 2H ₂ O e NaOH mantidos em uma razão molar de 2:5. A mistura contendo o CuCl ₂ · 2H ₂ O e GK foram agitados a 250 rpm a uma temperatura de 75 ° C durante 1 h em um agitador orbital. A cor da mistura mudou gradualmente de azulado para preto, indicando a formação de NPs de CuO. O precipitado resultante foi obtido por centrifugação e lavado primeiro com etanol e depois com água DI.

Caracterização de NPs sintetizados em verde

A concentração de metal nos NPs recentemente sintetizados foi medida usando espectrometria de massa de plasma acoplado indutivamente (ICP-MS, OPTIMA 2100 DV, Perkin Elmer).

A formação e estabilidade dos NPs metálicos foram avaliadas usando um espectrofotômetro Cintra 202 UV-Vis (GBC, Austrália), a estabilidade NP sendo determinada após 6 meses.

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) dos NPs Ag, Au, Pt, Pd e CuO foram obtidas usando um microscópio Tecnai F 12 (FEI, Thermo Fisher Scientific, Oregon, EUA) operando a uma tensão de aceleração de 15 kV. As amostras foram preparadas para análise de TEM, deixando cair 10–20 μL de dispersão de NP GK-inorgânico em uma grade de cobre e secando em temperatura ambiente, após a remoção do excesso de solução.

Condições de cultura de algas

Chlamydomonas reinhardtii foi cultivado em meio TAPx4 (arquivo adicional 1:Tabela S1, informações de apoio) a 20 ° C em uma incubadora (Infors, Suíça) equipada com um agitador girando continuamente a 100 rpm e um regime de iluminação de 114,2 μmol phot m ^{- 2} s ⁻¹ . As células de algas foram cultivadas a uma taxa exponencial para obter aproximadamente 10 ⁶ células / mL.

Caracterização de NPs no meio de exposição de algas

Distribuição de tamanho de NP em C. reinhardtii O meio TAPx4 foi medido usando a técnica de sedimentação centrífuga diferencial (DCS) em uma centrífuga de disco DC24000UHR (CPS Instruments Inc., EUA). As medições foram feitas a uma velocidade de rotação do disco de 24.000 rpm, e a sedimentação de partículas foi realizada usando um 8–24% ( w / w ) gradiente de densidade de sacarose. Antes de cada medição de amostra, o instrumento foi calibrado usando padrões de nanosfera de PVC (470 nm). Os NPs também foram caracterizados por mobilidade eletroforética, e a aproximação de Smoluchowski usada para determinar o potencial zeta (ZP) em um Zetasizer ZS (Malvern Instruments Ltd., Reino Unido). Cada medição foi realizada em 10 execuções com funções de autocorrelação de 10 s, cada resultado sendo obtido a partir de medições em triplicado da mesma amostra.

O método de ultrafiltração foi usado para determinar a quantidade de metal iônico no meio algal (Cheloni et al. [47]; Ma et al. [68]). Alíquotas retiradas em diferentes intervalos de tempo (2 e 24 h) foram centrifugadas por 30 min a 7500 rpm para separar as partículas e agregados. O sobrenadante foi então filtrado através de filtros de ultrafiltração Amicon Ultracel 3K com um peso molecular de corte de 3 kDa (Millipore, EUA) para separar os íons das partículas. NPs e agregados com um diâmetro maior que 1,3 nm foram retidos no filtro, e o filtrado foi analisado por ICP-MS para íons dissolvidos [68].

A geração de ROS abióticos com concentração crescente de NPs em meio de algas foi determinada usando diacetato de diclorodihidroflouresceína fluorescente (H ₂ DCF-DA, Sigma – Aldrich, Suíça), conforme descrito em estudos anteriores [47, 69].

Efeito de NPs no crescimento de algas, integridade da membrana e geração de estresse oxidativo

O efeito dos NPs de metal e óxido de metal no crescimento de algas, integridade da membrana e geração de estresse oxidativo foi testado usando citometria de fluxo (FCM; BD Accuri C6 Flow Cytometer, BD Biosciences, EUA). O experimento foi realizado em frascos transparentes (PS, 50 mL, Semadeni, Suíça) contendo 5 mL de suspensão de algas e NPs nas concentrações de 1, 5, 10 e 20 mg / L. As amostras de controle sem NPs foram executadas em paralelo. Células de algas foram aquecidas em água fervente (100 ° C) por 15 min, a fim de fornecer um controle positivo para membranas celulares danificadas. Células de algas também foram tratadas com cominho (Sigma-Aldrich, EUA), um agente de espécies oxidativas, por 30 min no escuro como um controle positivo do estresse oxidativo (ROS). Todas as amostras não tratadas e amostras tratadas com NPs foram incubadas em condições semelhantes às adotadas para manter as culturas. Sub-amostras foram coletadas após 1, 3, 5 e 24 h para avaliar o efeito dos NPs na integridade da membrana celular e estresse oxidativo usando FCM. Uma alíquota de 250 μL de cada amostra foi transferida para uma placa de fundo plano de 96 poços Microtiter®. Para avaliar a integridade da membrana celular, sondas fluorescentes de iodeto de propídio (PI) (P4170, Sigma-Aldrich, EUA) foram adicionadas à amostra em uma concentração final de 7 μM. Para detecção de estresse oxidativo, CellROX® Green Reagent (ROS) (C10444, Life Technologies, EUA) foi adicionado às amostras de acordo com as instruções do produto. Em suma, o PI liga-se ao DNA e liga-se ao RNA após a penetração intracelular através das membranas celulares danificadas, mas é excluído das células saudáveis. CellROX® Green Reagent é uma sonda para medir o estresse oxidativo em células vivas. O corante permeante celular é fracamente fluorescente enquanto em um estado reduzido, mas exibe fluorescência fotoestável verde brilhante após oxidação por ROS e subsequente ligação ao DNA. Assim, seu sinal está localizado principalmente no núcleo e na mitocôndria. As placas foram incubadas no escuro por 20 min (PI) e 30 min (ROS) antes da medição FCM. As suspensões de algas foram então passadas através do FCM com um laser de excitação azul 488 nm. CellROX Green foi medido no canal FL1 533/30 nm, fluorescência vermelha PI no canal FL2 585/40 nm e a autofluorescência vermelha da clorofila a ( Chla ) no canal FL3> 670 nm. O experimento foi realizado em duplicata e repetido.

Os dados do FCM foram analisados ​​com o software CFlow Plus (BD Biosciences, EUA). As amostras foram bloqueadas, com base nas propriedades de espalhamento direto e autofluorescência vermelha de Chla , para eliminar sinais de NPs, detritos e outros contaminantes. O número de células, a porcentagem de membranas celulares danificadas ou células com estresse oxidativo e os dados de autofluorescência foram recuperados com base na autofluorescência de Chla (670 nm), células marcadas com PI (585 nm) e ROS Verde (533 nm) (arquivo adicional 1:Figura S1).

Eficiência do fotossistema de algas II

Suspensões de NPs de metal e óxido de metal foram adicionadas à mesma cultura de algas (aproximadamente 10 ⁶ células / mL) em frascos de vidro de 15 mL para atingir as concentrações finais de 1, 5, 10 e 20 mg / L. Culturas de algas sem NPs foram preparadas como controles negativos. Todas as amostras foram então transferidas para uma incubadora nas mesmas condições utilizadas para as culturas de algas originais. Alíquotas (2,2 mL) de cada amostra foram retiradas imediatamente e após 1, 3, 5 e 24 h de incubação para detectar o rendimento quântico do fotossistema II (QY) usando um fluorômetro AquaPen-C AP-C 100 (PSI Ltd., Czech República). Todas as medições foram realizadas em triplicado. QY representa a razão de fluorescência variável ( F _v = F _m - F ₀ ) para fluorescência máxima ( F _m ), com QY = F _v : F _m usado como um proxy da eficiência de extinção fotoquímica [70]. F _m foi obtido aplicando iluminação a 680 nm por alguns segundos antes e no final da iluminação, com fluorescência mínima ( F ₀ ) sendo a medição inicial no nível mínimo de fluorescência na ausência de luz fotossintética.

Análise estatística

O efeito de NPs de metal e óxido de metal em C. reinhardtii foram testados usando a análise de variância ANOVA e o teste de Dunnett (GraphPad PRISM, EUA). Os níveis de significância foram definidos em * P <0,05, ** P <0,01 e *** P <0,001.

Resultados

Formação e caracterização primária de NPs

Imagens TEM de Ag, Au, Pt, Pd e CuO NPs sintetizados usando GK mostram NPs esféricos bem separados com diâmetros variando de 2 a 100 nm (Fig. 1a-e). Soluções aquosas de NPs coloidais examinadas sob espectroscopia UV-Vis (Fig. 1f) exibiram ressonância plasmônica de superfície distinta em 412 e 525 nm, consistente com a formação de NPs Au e Ag dentro da rede GK. Nenhuma ressonância de plasmon de superfície distinta foi observada para Pt, Pd ou CuO NPs. As medições de UV-Vis após 6 meses confirmaram a estabilidade de todos os NPs, os espectros exibindo um único pico com um tamanho médio semelhante aos NPs recentemente sintetizados (arquivo adicional 1:Figura S2).

Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de a Au, b Pt, c Ag, d Pd e e Nanopartículas de CuO sintetizadas usando goma karaya e seus sais metálicos correspondentes. a , b , c , d e e inserções de gráfico mostram a distribuição de tamanho de partícula de pico por peso de nanopartículas em meio de algas, conforme determinado por sedimentação centrífuga diferencial. (F) Espectros de UV-Vis para as nanopartículas de Au, Ag, Pt, Pd e CuO

Caracterização de NPs no meio de exposição de algas

O tamanho das NPs, com base na distribuição de peso, variou de 180 a 5 nm como segue:CuO> Au> Pt> Ag> Pd. Todos os NPs foram carregados negativamente em pH 7 (Tabela 1 e arquivo adicional 1:Figura S3). Os NPs de Pt, Ag e CuO tiveram as concentrações de metal iônico mais altas (33–36 μg / L), e os NPs de Au e Pt as mais baixas (6–7 μg / L) (Tabela 1). As formas iônicas dos metais foram detectadas no meio algal (Tabela 1).

Efeito no crescimento de algas

Não afetado C. reinhardtii cultura teve uma taxa de crescimento de 1 × 10 ⁶ células / h. Na presença de 1 mg / L de Ag, Pd e CuO NPs, a taxa de crescimento diminuiu drasticamente para 2,2 × 10 ⁴ , 1,7 × 10 ⁴ e 0,2 × 10 ⁴ células / h, respectivamente ( P <0,001). À medida que a concentração de NP aumentou ainda mais, o crescimento das algas foi completamente inibido (Fig. 2). Quando as algas foram expostas a NPs de Au e Pt, a taxa de crescimento também foi significativamente reduzida em comparação com o controle ( P <0,001), mas o aumento das concentrações não aumentou o efeito.

Taxa de crescimento de Chlamydomonas reinhardtii exposto a nanopartículas de metal e óxido metálico de Au, Pt, Pd, Ag e CuO (1, 5, 10 e 20 mg / L). A taxa de crescimento para o controle não exposto (cultura de algas) foi 1 × 10 ⁶ células / h após 24 h. As barras de erro representam o desvio padrão de experimentos repetidos usando amostras duplicadas

Geração de estresse oxidativo nas células

O estresse oxidativo variou dependendo do tipo de NP (Fig. 3). O efeito mais alto, com quase 100% das células afetadas, foi causado por 5–20 mg / L de NPs de Ag e CuO (Fig. 3d, e e Arquivo adicional 1:Tabela S2). Quando as células de algas foram expostas a NPs de Au, o estresse oxidativo foi muito menor, com a maioria <10% das células afetadas. As maiores concentrações de Au NPs (20 mg / L) afetaram apenas 15% das células ( P <0,001). A porcentagem de células estressadas diminuiu gradualmente ao longo do tempo, sem estresse oxidativo detectado após 24 h para todas as concentrações de Au testadas (Fig. 3a). Pt NPs causou estresse oxidativo em menos de 8% das células de algas durante as primeiras 5 horas de exposição (Fig. 3b). Apenas nas concentrações de 10 e 20 mg / L o estresse foi gerado em 10 e 19% das células, respectivamente, após 24 h ( P <0,001; Arquivo adicional 1:Tabela S2), sem estresse detectado em concentrações mais baixas ( P > 0,1) após 24 h de exposição (Fig. 3b). A exposição a 1 mg / L de Ag NPs falhou em induzir estresse oxidativo em células de algas ao longo de um período de 24 h ( P > 0,9). No entanto, a exposição a 5 mg / L resultou em estresse oxidativo após 5 h, e a exposição a 10 e 20 mg / L resultou em estresse oxidativo após 3 h. Após 24 h de exposição a Ag NPs, 100% das células estavam estressadas ( P <0,001; Fig. 3c e arquivo adicional 1:Tabela S2). CuO NPs induziram significativo ( P <0,001) estresse oxidativo em células de algas mais rapidamente (3 h) do que os outros NPs de metal testados a 10 e 20 mg / L (Arquivo adicional 1:Tabela S2), exceto para Ag NPs. O estresse oxidativo já era significativo a 5 mg / L após 5 h. Todas as concentrações (> 5 mg / L) tiveram um efeito significativo no estresse oxidativo celular (Fig. 3d, e). Como parâmetro complementar, também determinamos as ROS abióticas geradas pelos NPs. Em contraste com C. reinhardtii taxa de crescimento e porcentagem de C. reinhardtii células exibindo estresse oxidativo, Au NPs gerou apenas um ligeiro aumento em ROS abióticos ( P > 0,05; Arquivo adicional 1:Figura S4).

Porcentagem de Chlamydomonas reinhardtii células que exibem estresse oxidativo após exposição a concentrações crescentes (1, 5, 10 e 20 mg / L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag e e Nanopartículas de CuO após 1, 3, 5 e 24 h. As barras de erro representam o desvio padrão de experimentos repetidos usando amostras duplicadas. Observe y diferente - escalas de eixo para Au e Pt

Efeito na integridade da membrana de algas

NPs de Au e Pt causaram significância ( P <0,001) dano à membrana celular em todas as concentrações de 1 a 5 h (arquivo adicional 1:Tabela S3); no entanto, nenhum efeito significativo ( P > 0,05) foi observada após 24 h (Fig. 4a, b). No caso de Ag NPs, 100% das células foram danificadas ( P <0,001) após 1 h de exposição a 1–20 mg / L (Fig. 4c, Arquivo adicional 1:Tabela S3, Ag). A porcentagem de membranas celulares danificadas após a exposição a NPs de 1 e 5 mg / L Pd (Arquivo adicional 1:Tabela S3, Pd) foi comparável àquela para o controle ao longo de 24 h ( P > 0,4). Por outro lado, danos significativos ( P <0,001) foi observada após 24 h de exposição a 20 mg / L Pd NPs (Fig. 4d). O efeito do CuO aumentou com o aumento da concentração e do tempo, atingindo seu maior impacto após 24 h (Fig. 4e e Arquivo adicional 1:Tabela S3).

Porcentagem de Chlamydomonas reinhardtii células com membranas danificadas após exposição a concentrações crescentes (1, 5, 10 e 20 mg / L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag e e Nanopartículas de CuO após 1, 3, 5 e 24 h. As barras de erro representam o desvio padrão de experimentos repetidos usando amostras duplicadas. Observe y diferente - escalas de eixo para Au e Pt

Efeito na clorofila ( Chl ) Fluorescência

Chl a fluorescência não foi significativamente afetada ( P > 0,1) por Au NPs em qualquer concentração durante o período de 24 he por Pt durante o período de 5 h (Fig. 5a, be Arquivo adicional 1:Tabela S4). Por outro lado, os NPs Ag, Pd e CuO inibiram fortemente ( P <0,001) Chl fluorescência com concentração e tempo de exposição crescentes, e. Chl a fluorescência foi reduzida de 98% (1 h) para 22% (24 h) ( P <0,001) quando as células de algas foram cultivadas na presença de 5 mg / L Ag (arquivo adicional 1:Tabela S4). Uma redução semelhante na fluorescência também foi observada para 10 e 20 mg / L Ag, com os níveis caindo para 20 e 9% ( P <0,001), respectivamente (Fig. 5c). NPs de CuO e Pd (ambos 20 mg / L) causaram um declínio acentuado em Chl fluorescência após 24 h ( P <0,001). Não houve efeito observável ( P > 0,1), no entanto, para 1 ou 5 mg / L de Pd e para 1 mg / L de NPs de Ag e CuO (Fig. 5c-e).

Porcentagem de Chlamydomonas reinhardtii células com clorofila ( Chl ) fluorescência após exposição a concentrações crescentes (1, 5, 10 e 20 mg / L) de a Au, b Pt, c Pd, d Ag e e Nanopartículas de CuO após 1, 3, 5 e 24 h. As barras de erro representam o desvio padrão de experimentos repetidos usando amostras duplicadas

Efeito de NPs no fotossistema de algas II

Os NPs Au, Pt e CuO tiveram um efeito ligeiramente significativo ( P <0,05) no fotossistema II QY em alguns pontos de tempo durante o período de 24 horas em concentrações que variam de 1 a 20 mg / L (Fig. 6 e arquivo adicional 1:Tabela S5). Por outro lado, QY foi significativamente reduzido ( P <0,001) após apenas 1 hora após o contato com Ag NPs em todas as concentrações (Fig. 6c e arquivo adicional 1:Tabela S5). Os NPs de Pd e CuO resultaram em uma redução significativa em QY na concentração mais alta de 20 mg / L (Fig. 6d, e e Arquivo adicional 1:Tabela S5).

Efeito de a Au, b Pt, c Pd, d Ag e e Nanopartículas de CuO (1, 5, 10 e 20 mg / L) na eficiência do fotossistema II (QY%) após 1, 3, 5 e 24 h. Cem por cento no y -eixo representa o QY da cultura de algas de controle sem nanopartículas. As barras de erro representam o desvio padrão de experimentos repetidos de amostras duplicadas

Discussão

No presente trabalho, pretendemos explorar a eliminação da produção de resíduos tóxicos durante a síntese de nanomateriais de metal e óxido de metal na implementação da abordagem da química verde [16, 57, 58], com ênfase principal no uso de dispersantes ambientalmente benignos e materiais renováveis ​​e biodegradáveis. Usamos com sucesso o GK, um material natural, renovável e biodegradável para a síntese e estabilização de uma série de NPs. Usando água DI como solvente, os grupos funcionais presentes em GK (ou seja, –OH e –COO–) atuaram como agentes redutores e o próprio polímero GK atuou como um agente de cobertura para os NPs formados, permitindo assim a síntese verde de NPs [59, 68]. Os NPs sintetizados em nosso estudo (Au, Pt, Pd, Ag e CuO) foram comparáveis ​​em termos de tamanho, estabilidade e custo-efetividade a outros NPs sintetizados em verde de estudos anteriores [13, 69].

Em seguida, usamos uma gama de concentrações em nanoescala (1–20 mg / L) relacionadas às concentrações ambientais esperadas ou registradas [39, 71,72,73] para avaliar o efeito biológico dos NPs em C. reinhardtii usando pontos de extremidade, como crescimento de algas, integridade da membrana, Chl eficiência do fotossistema II de fluorescência e estresse oxidativo. Nossos resultados revelaram dois agrupamentos distintos:NPs de Au e Pt tendo pouco ou nenhum efeito na alga, e NPs de Ag, Pd e CuO exibindo um forte efeito em quase todos os pontos finais (Arquivo adicional 1:Tabela S6). Estudos de toxicidade de NPs de metal ou óxido de metal identificaram várias características físico-químicas importantes de NPs que podem estar relacionadas à sua toxicidade, incluindo composição, revestimento, tamanho, forma e homo ou heteroagregação [69, 74,75,76,77, 78]. Além disso, a toxicidade do metal dissolvido (forma iônica) foi demonstrada anteriormente em algas usando uma variedade de critérios, incluindo geração de ROS intracelular, Chl depleção e inibição da fotossíntese [79,80,81]. Detectamos claramente a geração de ROS e um efeito no crescimento, Chl produção e fotossistema II após exposição a NPs de Ag, Pd e CuO.

Embora os NPs Pd geralmente tenham sido considerados um grupo tóxico, eles não foram amplamente estudados e só recentemente foram reconhecidos como NPs antibacterianos importantes [41]. It is generally believed that the small size (1.5–3 nm) of Pd NPs contributes toward their antibacterial attributes, possibly facilitating transport to cells through bacteria or algal cell wall pores, which have diameters ranging from 5 to 20 nm [82, 83]. In our study, Pd NPs of 1.5 nm mean size could directly enter algal cell walls and cause damage when releasing ions in the cell membrane and chloroplasts (Chl fluorescence, PS II, ROS). There is clear evidence that soluble Pd salt was able to enter P. subcapitata cells, where Pd precipitates were mostly formed in chloroplasts [78] which could increase generation of ROS and thus oxidative stress. It was also reported that Pd NPs (127 nm z -average hydrodynamic size) were less toxic toward P. subcapitata than soluble Pd salt [69] maybe due to larger size of NPs that could not directly enter the cells, while Pd salt could. On the other hand, Pd NPs could form hetero-aggregates with algal cells leading to physical entrapment. Surprisingly, the entrapment is not inevitably lethal because the cells could recover their growth after transfer to clean medium [69].

Numerous studies have shown that Ag NPs toxicity to algae was mainly driven by Ag ions dissolved in the exposure medium rather than Ag NPs and also depended on Ag NPs coatings and sizes [80, 84,85,86,87,88,89]. Our study revealed high toxicity of Ag NPs thus suitable for algicidal applications. The ionic Ag and/or Ag NPs (5 nm) could directly enter algal cells [90], causing damage to the cell membranes and other cellular compartments by ROS formation. Moreover, Ag NPs could damage algal cells by direct interaction between NPs and algal cells [72] or the type of NPs coating could play a significant role. For example, dexpanthenol, polyethylene glycol and polyvinyl polypyrrolidone coatings caused a similar effect as AgNO₃ on C. reinhardtii , while carbonate, chitosan, and citrate decreased the Ag effect on photosynthesis [87]. Our Ag NPs showed strong effect toward C. reinhardtii regardless GK coating.

The ecotoxicity of CuO NPs has been extensively studied [36, 47,48,49, 69, 91]. We observed CuO NPs harming cell membranes right after 1 h, while the ROS elevated after 3 h at concentrations higher than 5 mg/L and also Chl fluorescence substantially decreased over 24 h. It is possible that the CuO NPs (or ionic Cu)-damaged membranes could increase further uptake of Cu and oxidative stress in the C. reinhardtii cells [91] where observed hetero-aggregation of NPs and the cells (data not shown) could even enhance this interaction. von Moos et al. [36] stated that free Cu ²⁺ or the NPs themselves were the main mediators of toxicity toward C. reinhardtii , while Cheloni et al. [47] believed ion Cu at lower CuO NPs concentrations was the driving force, being unable to clarify the contribution of dissolved Cu in CuO NPs . This was probably elucidated by other study revealed much stronger effect of soluble ionic Cu and soluble fraction of CuO NPs on P. subcapitata than bare CuO NPs [69].

Au NPs slightly increased membrane impairment and oxidative stress after 3 and 5 h, but these effects disappeared after 24 h. Interestingly, abiotic ROS were constantly generated during whole 24 h study contrary to all other NPs. We assume that stable conditions allowed the cells to cope with such small level of stress. Previous study has reported a range of EC50 values for dissolved Au on C. reinhardtii of between 5.9 and 1.7 mg/L, depending on exposure time [92]. In our opinion, almost any Au NP toxicity would not have been exacerbated or affected by the degree of ion Au and would have had nearly no bearing on any of the criteria adopted for our experiments. Moreover, Au NPs seemed to be well dispersed in exposure media and we did not observe any aggregates or direct interactions with the C. reinhardtii cells (data not shown).

We found that Pt NPs caused slight Chl and a growth rate decrease after 24 h for all concentrations. These not so pronounced effects could be caused by both ionic Pt and Pt NPs. Up to now, there has been only limited knowledge about the toxicity of Pt NPs on algae. For example, Pt NPs decreased growth rate, and Chl fluorescence and oxidative stress on P. subcapitata and C. reinhardtii [39, 40]. The latter authors also suggested that the toxicity of Pt NPs might be only partly attributed to dissolved form of Pt in the case of P. subcapitata and that also the shading effect might influence toxicity [40]. In our study, we did not find such evidence.

Conclusions

Green-synthesised metal and metal oxide NPs were produced at nanoscale sizes of 42 nm (Au), 12 nm (Pt), 1.5 nm (Pd), 5 nm (Ag) and 180 nm (CuO):all with a negative charge. GK, a natural hydrocolloid, was successfully applied as a safe, cost-effective stabiliser and showed no aggregation (all NPs) after 6 months at + 4 °C. The biological effect (algal growth, membrane integrity, oxidative stress, Chl fluorescence and photosystem II efficiency) of these NPs was investigated on green alga C. reinhardtii . All NPs had a significant effect on algal growth rate; however, Au and Pt NPs inhibited algal growth far less than the other NPs (Pd, Ag and CuO). In terms of other biological effects, Pd, Ag and CuO NPs caused significant cell membrane damage, highly affected Chl fluorescence and caused oxidative stress. Ag and Pd NPs mostly inhibited photosystem II, while it was not much affected by CuO (only the highest concentration of 20 mg/L significantly decreased QY) and Au or Pt. Generally, metal and metal oxide NPs were successfully synthesised following green chemistry rules, without harmful side-products and showing high stability. Some could find reasonable application in algicides (Ag and CuO) or antimicrobial surfaces (Pd, Ag and CuO), while Au and Pt proved to be almost non-toxic to green alga C. reinhardtii .

Influência do parâmetro de ajuste de pH para modificação de sol-gel na estrutura, microestrutura e propriedades magnéticas da ferrita de estrôncio nanocristalina Estudos teóricos sobre fotodiodos de avalanche de InGaAs / InAlAs SAGCM