Verde sintetizado fitoquimicamente (Zingiber officinale e Allium sativum) Nanopartículas de óxido de níquel reduzidas com potencial bactericida e catalítico confirmado

Resumo

Nanopartículas fito-sintetizadas (NPs) com toxicidade química reduzida têm sido focadas globalmente e se tornaram um componente essencial da nanotecnologia recentemente. Preparamos o verde fitoquimicamente (gengibre e alho) com NiO-NPs reduzidos para substituir o bactericida sintético e o agente catalítico na indústria têxtil. NPs foram caracterizados usando espectroscopia ultravioleta visível (UV-Vis), difração de raios-X (XRD), espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS), espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de raios-X dispersiva de energia (EDS ), microscopia eletrônica de varredura (SEM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A síntese de NPs foi confirmada por XRD e UV-Vis com forte absorção a 350 nm com tamanho variando entre 16–52 nm para gengibre e 11–59 nm para alho. A microscopia eletrônica de varredura e transmissão confirmou o pleomorfismo com NPs de formato cúbico e mais esférico. Além disso, as quantidades exatas de extratos de alho e gengibre (1:3,6 ml) incorporados para sintetizar NiO-NPs foram confirmadas com sucesso pelo FTIR. NPs fitoquimicamente reduzidos pelo alho apresentaram maior atividade bactericida contra Staphylococcus aureus resistentes a múltiplos medicamentos em concentrações crescentes (0,5, 1,0 mg / 50 μl) e também degradou o corante azul de metileno (MB) de forma eficiente. Conclusivamente, NiO-NPs verdes sintetizados são ativistas iminentes para resolver a resistência aos medicamentos, bem como agentes catalíticos ecológicos que podem ser optados em escala industrial.

Introdução

A nanotecnologia influencia a matéria com pelo menos um tamanho de dimensão 1-100 nm que fornece a capacidade de projetar material controlando seu tamanho [17]. NPs devido às suas propriedades químicas, físicas e biológicas únicas em vários campos, incluindo a medicina, têm recebido grande atenção. Suas propriedades podem ser facilmente alteradas mudando o tamanho em escala nanométrica [47].

NPs de níquel (Ni) e óxido de níquel (NiO) têm grande importância devido às suas propriedades magnéticas, catalíticas e eletrônicas particulares em tecnologia de energia, magnetismo, biomedicina e eletrônica [9, 26, 35]. NiO com um gap largo de 3,6 a 4,0 eV e estrutura de rede cúbica tem potencial devido ao semicondutor do tipo p. Esses NPs com alta estabilidade química, propriedades de supercapacidade, capacidade de transferência de elétrons e eletrocatálise estão sendo usados ​​em biomedicina e atividades fotocatalíticas, antiinflamatórias e antibacterianas [8, 10, 11, 45]. O surgimento de doenças infecciosas, especialmente resistentes a antibióticos (MDR), devastou a saúde pública em todo o mundo. Geralmente, as cepas bacterianas patogênicas Gram-positivas (G + ve) e Gram-negativas (G-ve) estão entre as principais ameaças à saúde pública.

Na indústria de laticínios, a mastite bovina é uma das principais doenças problemáticas tendo grande impacto econômico caracterizada por alterações químicas, microbiológicas e físicas no leite, enquanto alterações patológicas nos tecidos glandulares do úbere [6, 19]. A etiologia da mastite inclui agentes infecciosos, ou seja, bactérias, vírus e fungos e mais importantes são as bactérias, divididas em dois grupos:principais ( Streptococci, Staphylococcus aureus , Corynebacterium pyogenes e Coliform ) e patógenos menores ( Corynebacterium bovis e estafilococos coagulase-negativos ) [25]. O surgimento de múltiplas cepas de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas resistentes a drogas representa uma ameaça significativa à saúde pública [23, 32].

Zingiber officinale (gengibre) é um ingrediente importante na Ayurvedia e Unani, e a fitoterapia chinesa é tratada para várias doenças, como antináuseas, ajuda digestiva, reumatismo e distúrbios hemorrágicos devido à grande diversidade de óleos voláteis como zingiberol, monoterpeno, sesquiterpeno e hidrocarbonetos sesquiterpênicos [12, 13, 43]. No entanto, Allium sativum (alho) contém componentes organo-enxofre, isto é, grupos sulfeto de alila, alina, ajoene, alil cisteína e alicina, e outros como vitaminas, fosfolipídios, flavonóides, aminoácidos e ácidos graxos que orientam suas propriedades médicas [14, 24] . Nosso objetivo foi avaliar a ação bactericida de NPs de óxido de metal Ni fitoquimicamente reduzido contra MDR ( S. aureus ), um isolado de mastite bovina, e este será o primeiro relato do Paquistão na área de pesquisa veterinária sobre o agente acima mencionado.

Métodos

O presente estudo teve como objetivo investigar a ação bactericida de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos contra MDR ( S. aureus ), um isolado de mastite bovina.

Materiais

Nitrato de níquel [Ni (NO ₃ ) ₂ ], hidróxido de sódio (NaOH), azul de metileno (MB) e boro-hidreto de sódio (NaBH ₄ ) de grau analítico foram adquiridos da Sigma-Aldrich®, e gengibre fresco e raízes de alho foram coletadas no mercado local. As raízes foram secas à sombra para atingir peso constante para processamento posterior. Os discos de antibióticos foram adquiridos em Bioanalyse® (Turquia). Os meios de crescimento bacteriano usados ​​eram de qualidade analítica por TM Media, (Titan Biotech Ltd, Índia).

Preparação de extratos aquosos

Raízes de gengibre e alho foram pulverizadas em pó fino usando um moedor elétrico e preservadas em recipientes de plástico. O pó da raiz moída foi misturado com quantidade controlada de água destilada-DIW (1:10) sob agitação vigorosa a 70 ° C por 30 min. Os extratos foram resfriados, filtrados por papel de filtro Whatman No.1 e armazenados a 4 ° C (Fig. 1) até o uso posterior.

Esquema de síntese de extração de gengibre e alho e NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos

Síntese Verde de NiO-NPs

Extratos aquosos de gengibre e alho de várias proporções (1,2, 1,8, 2,4, 3,0, 3,6 e 4,2 ml) foram adicionados a nitrato de níquel (0,1 M) sob agitação contínua. A solução agitada com pH 12 foi mantida usando NaOH (2 M) a 90 ° C durante 2 h. Os precipitados formados foram centrifugados a 10.000 rpm por 10 min, lavados com DIW e foram secos durante a noite em forno de ar quente a 90 ° C ilustrado na Fig. 1.

Caracterização

Máximos de absorção ( ƛ _máximo ) de NPs sintetizados foram digitalizados por espectrofotômetro UV-Visível (Genesys 10 S) de comprimentos de onda de 200–800 nm. A composição da fase e a informação estrutural foram analisadas por difração de raios-X (XRD) BUNKER D2 phaser com faixa 2θ de (10-80 °) equipado com radiações Cu Kα1 de λ =1,540 Å. Grupos funcionais de NiO-NP sintetizados em verde foram registrados usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR). Tamanho, forma e análise elementar de NPs foram analisados ​​por microscópio eletrônico de emissão de campo (FESEM) e microscopia eletrônica de transmissão Hitachi H7100FA (TEM). A composição da amostra com lacunas de banda correspondentes foi investigada por espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS).

Isolamento e identificação de MDR S. aureus

Isolamento de S. aureus

Amostras de leite bovino clinicamente positivas coletadas de hospitais veterinários e fazendas dos setores público e privado em Punjab, Paquistão, foram cultivadas em ágar sangue de ovelha a 5% e incubadas a 37 ° C por 24–48 h. As colônias características obtidas foram posteriormente semeadas em agar de sal de manitol (MSA) TM Media (Titan Biotech Ltd, Índia) em tripletos para isolar S. purificado. aureus .

Identificação de MDR S. aureus

A identificação de colônias bacterianas foi feita por meio de características morfológicas, coloração de Gram e procedimentos bioquímicos (teste de coagulase e catalase) de acordo com a descrição do manual de bacteriologia determinativa de Burgey.

A susceptibilidade aos antibióticos de colônias características foi avaliada pelo teste de difusão em disco com base nas diretrizes do Comitê Nacional de Padrões de Laboratório Clínico (NCCLS) para isolamento de MDR S. aureus . Discos de antibióticos contendo oxitetraciclina (30 μg), tilosina (30 μg), gentamicina (10 μg), ciprofloxacina (5 μg) e trimetoprima + sulfametoxazol (1,25 μg + 23,75 μg) aplicados assepticamente no meio de Mueller-Hinton TM (MHA) (Titan Biotech Ltd, Índia) 1 × 10 ⁸ CFU / ml foram mantidos a 37 ° C por 24 h [7]. A bactéria encontrada resistente a um mínimo de três antibióticos foi declarada MDR [28].

Atividade Antimicrobiana

O potencial de ação antimicrobiana in vitro de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos foi avaliado pelo método de difusão em ágar em dez isolados representativos de MDR S. aureus coletado do leite mastítico. As placas de Petri foram esfregadas com 1,5 × 10 ⁸ CFU / ml (padrão de 0,5 McFarland) MDR S. aureus no MSA. Poços de 6 mm de diâmetro foram formados usando broca de cortiça estéril. Foram aplicadas várias concentrações de extratos aquosos individuais de gengibre, alho e NiO-NPs verdes sintetizados (fitoquimicamente reduzidos). Extratos aquosos foram utilizados nas concentrações de (10 mg / 100 μl) e (50 mg / 100 μl) e NiO (0,5 mg / 50 μl) e (1,0 mg / 50 μl). Ciprofloxacina (0,005 mg / 50 μl) foi usada como controle positivo e DIW como controle negativo (50 μl).

Análise estatística

A eficácia antimicrobiana foi calculada em termos do tamanho da zona de inibição (mm) e os diâmetros da zona de inibição foram analisados ​​estatisticamente por análise de variância unilateral (ANOVA) usando SPSS 20.

Catálise

Para avaliação catalítica do extrato sintetizado de NiO, boro-hidreto de sódio aquoso recém-preparado (300 μl) foi misturado com 3 ml de azul de metileno (0 . 03 × 10 ⁻³ M) solução. Posteriormente, 300 μl de amostra coloidal de concentração desejada foram adicionados às soluções. A cor azul clara do corante azul de metileno (MB) desapareceu, representando a degradação do corante em azul de leucometileno, conforme mostrado na Fig. 2. A absorção foi observada entre 200-800 nm usando espectrofotômetro UV-Vis.

Diagrama esquemático para redução catalítica de MB para LMB por NPs verdes sintetizados

Resultados e discussão

Propriedades ópticas de NiO fitoquimicamente reduzido por extratos aquosos de gengibre e alho entre 200-600 nm são apresentadas na Fig. 3a, b. A absorbância máxima ( λ _máximo ) em NiO-NPs foi observada em torno de 350 nm (1:3,6 ml), que aumentou com a concentração dos extratos acompanhada de desvio para o azul. Os picos de absorção dos extratos de gengibre e alho apareceram em torno de 275 e 280 nm, respectivamente. Mudança abrupta de cor nas misturas de reação foi observada de vermelho vinho para verde claro após a incorporação de extratos de raiz. A largura do pico indicou aglomeração de partículas e transição eletrônica de bandas de valência para condução com concentração de extrato em NiO conforme revelado por fortes bandas de absorção [20]. Assim, na Fig. 3a, os resultados b mostraram diminuição na absorção de NPs sintetizados com o aumento ou diminuição do volume do extrato além do valor otimizado (1:3,6 ml). O gap foi calculado usando o gráfico de Tauc (Eq. 1).
$$ \ left (\ alpha hv \ right) =B {\ left (hv- {E} _g \ right)} ^ {\ raisebox {1ex} {$ 1 $} \! \ left / \! \ raisebox {-1ex } {$ 2 $} \ right.} $$ (1)
a - d Espectros de absorção de NiO-NPs verdes sintetizados com gengibre ( a ) e extrato de alho ( b ) Band gap de NiO fitoquimicamente reduzido pelo gengibre ( c ) e alho ( d ) respectivamente

Onde α é o coeficiente de absorção, h é a constante de Planck, B é uma constante, υ é conhecido como frequência de fótons, e E _g é o bandgap de energia. O bandgap estimado de NiO fitoquimicamente reduzido por gengibre e alho de uma parcela de ( αhʋ ) ^1/2 contra a energia do fóton ( hʋ ) A interceptação de uma tangente a x -eixo foi gravado, o que fornece energias de gap de amostras como mostrado na Fig. 3c, d. As variações nas energias do band gap foram determinadas após dopagem do gengibre em NiO de 4,15 a 3,1 eV e com alho de 3,5 a 3,0 eV, respectivamente (Fig. 3c, d).

A cristalinidade, o tamanho e a composição da fase de NiO-NPs foram confirmados por XRD como mostrado na Fig. 4 a, b. Os picos nos valores 2θ 37,10 °, 43,32 °, 62,81 ° e 76,51 ° correspondem a (111), (200), (220) e (311) (cartão JCPDS nº:00-047-1049) (Fig. 4a , b) referenciado por [30]. A intensidade de pico indica NiO hexagonal e cúbico centrado na face (fcc) com tamanho médio de 32,9 nm calculado por D =0,9λ / βcosθ para gengibre e 29,92 nm para alho NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos. Os picos amplos indicam a presença de espaços de oxigênio e desordem de rede local na amostra [38]. Vários fitoquímicos de gengibre (flavonóides, alcalóides, taninos e saponinas) e extratos aquosos de alho (alicina, sulfeto de alila, alina, ácidos graxos, glicolipídeos, fenólicos, aminoácidos e flavonóides) atuando como agentes de cobertura são responsáveis ​​pelo tamanho médio do cristalito de óxido de metal NPs [14, 46].

Padrão de XRD de diferentes concentrações de NiO fitoquimicamente reduzido pelo gengibre ( a ) e alho ( b ) e NiO padrão ( c )

Os espectros de FTIR registrados de NiO biossintetizados a partir de raízes de gengibre e alho são mostrados na Fig. 5 a, b. Elaborar ampla absorção em 3380 cm ⁻¹ correspondem a OH e a largura do pico indica o grupo carbonila com (N-H) frequência de alongamento da amina [50]. A absorção acentuada em 2313 cm ⁻¹ indica vibrações de alongamento de CO ₂ aéreo ou CO ₂ dentro de grãos NP. Absorção rápida de CO atmosférico ₂ indica maior área de superfície do material [18]. A ampla absorção em 1629 cm ⁻¹ correspondem ao alongamento do anel aromático C =C e picos agudos em 1392 e 1064 cm ⁻¹ correspondem às vibrações de alongamento das aminas alifáticas C – N [48]. Os picos intensos em 978 cm ⁻¹ confirmou a frequência de alongamento do metal com oxigênio do NiO [44].

Espectros de FTIR com extrato de gengibre para NiO ( a ) e alho ( b )

Os deslocamentos de pico observados após a bio-redução de NiO como 2535–2313, 1828–1629 e 1585–1392 cm ⁻¹ indicam fitoquímicos, terpenóides, flavonóides, polióis e proteínas com grupos funcionais cetonas, álcoois, ácido carboxílico e aminas responsáveis ​​pela quelação e cobertura na bio-redução [42].

A morfologia da superfície e o tamanho de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos foram determinados usando varredura de emissão de campo e microscopia eletrônica de transmissão, conforme apresentado na Fig. 6a-f. Os NiO-NPs apresentaram pleomorfismo com forma cúbica e mais esférica (<50 nm) tendo ligeira aglomeração [40]. A aglomeração de NPs pode ser evidente a partir da aderência do polímero e da interação magnética entre as partículas [49].

a - f Imagem SEM de NiO reduzido fitoquimicamente pelo gengibre ( a ) e alho ( b ) Imagem TEM de NiO fitoquimicamente reduzido com gengibre ( c ) e alho ( d ) e distribuição de tamanho de NiO fitoquimicamente reduzido pelo gengibre ( e ) e alho ( f )

A análise elementar e outras características de NiO-NPs sintetizados foram descritos por espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDS), que confirmou fases de NiO puras, como mostrado na Fig. 7a, b. Os espectros de EDS confirmaram três picos diretamente relacionados à alta pureza do Ni presente nas amostras testadas entre 1 e 10 kV. As porcentagens de peso atômico observadas através dos espectros para Ni, O, C e Zn são 54,69, 27,81, 18,06 e - 0,55, respectivamente.

a , b Espectro EDS de NiO-NPs verdes sintetizados

XPS está mostrando C1 s , O1 s e Ni2 p espectros de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos na Fig. 8a-d que sugere a natureza química e os estados de ligação das amostras sintetizadas. Os picos mais intensos em 284,8 e 286,2 eV demonstram C1 s espectro (Fig. 8b) correspondendo a C – C e C – OH / C – O – C [21]. O O1 s pico em 530,8 eV (Fig. 8c) pode ser atribuído a grupos hidroxila de átomos de oxigênio, átomos de oxigênio adjacentes a lacunas de níquel ou átomos de carbono ligados por oxigênio C =O [1, 15, 37]. A contribuição localizada em 532,2 eV é atribuída a átomos de oxigênio em moléculas de água absorvida (NiOH) [31, 41]. O Ni2 p espectro contendo Ni2 p 3/2 e Ni2 p 1/2 picos podem ser separados usando a função Gaussiana-Lorentziana em cinco componentes (Fig. 8d). Os picos mais intensos em 872,72 e 855,82 eV pertencem ao Ni2 p 1/2 e Ni2 p 3/2 com picos de satélite correspondentes de 879,36 e 861,57 eV, respectivamente [16]. A divisão spin-órbita entre o Ni (2 p 1/2) e Ni (2 p 3/2) e o nível do núcleo NiO-NP é de 17,28 eV, o que corresponde bem com relatórios anteriores [33, 34].

a - d Pesquisa XPS de partículas fitoquimicamente reduzidas ( a ), C1 s orbitais ( b ), O1 s espectros de NiO ( c ) e Ni2 p ( d )

A ação antimicrobiana / bactericida dos extratos de raiz de gengibre e alho e NiO-NPs verdes / fitoquimicamente reduzidos foi avaliada usando ensaio de difusão em ágar por meio de medição da zona de inibição (mm), conforme mostrado na Fig. 9a-d e na Tabela 1. Os resultados mostram forte relação entre a concentração de NP e as zonas de inibição (mm). Zonas de inibição significativas (mm) ( P <0,05) foram registrados para a amostra 1 (1,2 ml:1), 2 (1,8 ml:1), 3 (2,4 ml:1), 4 (3 ml:1), 5 (3,6 ml:1) e 6 ( 4,2 ml:1) variando (3–4,9 mm) e (3,05–5,2 mm) em concentrações baixas e altas de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos pelo gengibre (Fig. 9c, d), enquanto (3,15–5,3 mm) e (3,75– 5,9 mm) NPs fitoquimicamente reduzidos com alho contra MDR S. aureus (Fig. 9e, f) . Os extratos aquosos de raiz de gengibre apresentaram eficácia zero (Fig. 9a), e as raízes de alho mostraram zonas de inibição de 2,65 e 5 mm em baixas e altas concentrações, respectivamente (Fig. 9b). Todos os resultados foram comparados com o controle negativo DIW (0 mm) e o controle positivo com ciprofloxacina (12,55 mm). No geral, NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos com alho mostraram-se significativos ( P <0,05) aumento da ação bactericida contra MDR S. aureus.

a - f Atividade antimicrobiana in vitro do extrato aquoso de gengibre ( a ), alho ( b ), e NiO-NPs fitoquimicamente sintetizados por extrato de gengibre em doses baixas e altas ( c , d ) e alho ( e , f )

A diferença na tolerância ao estresse oxidativo depende de vários fatores como área de superfície, morfologia e tamanho de partícula do nanomaterial sintetizado que desempenha um papel inferencial no potencial de ação antibacteriana [29, 36]. Uma interação eletrostática entre cepas bacterianas e materiais em nanoescala resulta na geração de espécies reativas de oxigênio responsáveis ​​pela morte celular bacteriana [2,3,4,5,22]. Duas reações consideradas possíveis para reação de nanomaterial com cepas bacterianas, incluindo forte interação de cátions Ni ²⁺ com células bacterianas carregadas negativamente, resultando em colapso, enquanto a segunda reação resulta em excitação eletrônica da valência para a banda de condução após a irradiação da superfície de NiO com luz. Reação eletrônica adicional com O ₂ gera O ^- ₂ radicais resultando em H ₂ O ₂ Produção. A produção de · OH ocorreu após a reação de h ⁺ com água. Assim, resultando O ^- ₂ · E · As espécies OH desempenharam um papel significativo na quebra de lipídios ou moléculas de proteínas presentes na superfície externa das células bacterianas [39].

Atividade catalítica

A Figura 10 a – e demonstrando a redução catalítica de MB na presença de extratos de raiz e NiO-NPs verdes / fitoquimicamente reduzidos à temperatura ambiente. A Figura 10a mostra o potencial catalítico de NiO-NPs sintetizados pela rota convencional, enquanto (Fig. 10b, c) representa o potencial catalítico de extratos aquosos de raiz de gengibre e alho. A capacidade catalítica de NiO-NPs fitoquimicamente reduzidos é representada na Fig. 10d, e. É óbvio que NiO e extratos de raízes de plantas não são um nano-catalisador eficiente, pois consumiam 15, 21 e 38 minutos para a redução do azul de metileno (Fig. 10a-c). NPs fitoquimicamente reduzidos com gengibre mostraram degradação rápida ( λ _máximo =8 min) com conversão eficiente de MB em azul de leucometileno (Fig. 10d). NiO-NPs mediados por alho mostraram padrão semelhante de 100% de redução de corante em 5 min (Fig. 10e).

a - e Atividade catalítica de NiO ( a ), extrato de gengibre ( b ), extrato de alho ( c ), NiO fitoquimicamente reduzido pelo gengibre ( d ), e NPs reduzidos de alho ( e )

NPs verdes / fitoquimicamente reduzidos realizam degradação de corante catalítica significativa pela transferência de elétrons de espécies doadoras (BH ₄ ) para aceptor (MB) e estabilizar o sistema reduzindo a energia de ativação [27]. Os dados revelaram NPs verdes como nano-catalisador eficiente em comparação com NPs convencionais e extrato individual.

Conclusão

NiO-NPs com extratos de raiz de gengibre e alho serviram como excelente agente bactericida e catalítico. A incorporação do extrato de raiz com grupos fitoquímicos resultou na síntese bem-sucedida de NiO-NP revelada por FTIR. Os picos de XRD confirmaram a rede hexagonal e cúbica centrada na face (fcc) de NiO e a SEM confirmou o pleomorfismo com morfologia cúbica e mais esférica de NPs com tamanho médio 16-52 (dopagem de gengibre) e 11-59 nm (dopagem com alho). No entanto, a análise elementar revelou a natureza química e os estados de ligação analisados ​​por EDS e XPS e apresentou a porcentagem real de níquel e oxigênio, enquanto a análise de UV verificou diferença de picos de absorção na faixa de 350 nm e introduziu desvio para o azul em maior quantidade de dopantes. O alho fitoquimicamente reduzido NiO em alta concentração foi considerado mais potente em comparação com NPs reduzidos de gengibre contra MDR S. aureus bem como MB reduzido de forma eficiente. Assim, o NiO verde / fitoquimicamente reduzido de extratos de raiz de alho pode ser adotado na medicina avançada como substituto da resistência aos antibióticos e nas indústrias têxteis como agente catalítico sem risco para o meio ambiente.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados estão totalmente disponíveis sem restrição.

Abreviações

EDS:

Espectroscopia de raios-X de dispersão de energia

fcc:

Cúbico centrado no rosto

FTIR:

Espectroscopia infravermelha com transformada de Fourier

G + ve:

Gram positivo

G –ve:

Gram negativo

JCPDS:

Comitê conjunto sobre padrões de difração de pó

MB:

Azul de metileno

Ni:

Níquel

NiO:

Óxido de níquel

nm:

Nanômetro

NPs:

Nanopartículas

SEM:

Microscopia eletrônica de varredura

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

UV-Vis:

Espectroscopia ultravioleta visível

XPS:

espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

XRD:

Difração de raios X

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