Fulerenol solúvel em água com dependência de grupo hidroxila para inativação eficiente fotodinâmica excitada por dois fótons de micróbios infecciosos

Resumo

Preparamos com sucesso o fulerenol solúvel em água [C ₆₀ (OH) ₄₆ ] que exibiu um alto rendimento quântico de oxigênio singlete e espécies reativas de oxigênio geradas com eficiência. Além disso, o C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ com uma composição mais alta de grupos hidroxila expostos, tinham estabilidade e características superiores de dois fótons em comparação com uma composição mais baixa de tais grupos. Portanto, o fulerenol preparado pode ser um fotossensibilizador de dois fótons eficaz. O C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ tinha propriedades favoráveis de dois fótons. Durante a terapia fotodinâmica de dois fótons, o C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ teve atividade antimicrobiana substancial contra Escherichia coli em um nível de energia ultrabaixo de 211,2 nJ pixel ⁻¹ com 800 varreduras e um comprimento de onda fotoexcitado de 760 nm.

Introdução

Várias moléculas fotossensibilizadoras (PS) foram sintetizadas nas últimas décadas [1]. No entanto, as aplicações clínicas de PSs existentes envolvem vários problemas. A maioria das moléculas de PS são hidrofóbicas e podem facilmente agregar em meio aquoso, reduzindo assim seu rendimento quântico (QY) [2]. Além disso, PSs agregados não podem ser simplesmente injetados por via intravenosa. O acúmulo seletivo de moléculas de PS em tecidos falecidos também é necessário para prevenir danos às células saudáveis. Por causa desses problemas, o desenvolvimento de um portador de PS eficaz continua sendo um grande desafio para a terapia fotodinâmica (PDT). Consequentemente, o interesse em usar nanopartículas como carreadores de PS está aumentando.

O progresso da nanobiotecnologia tem estimulado o interesse nas aplicações biomédicas de uma nova classe de nanoestruturas [3,4,5,6,7,8,9,10,11] que são compostas exclusivamente por átomos de carbono, ou seja, o fulereno C ₆₀ , que são moléculas esferoidais (0,72 nm de diâmetro) que não são tóxicas e têm propriedades físico-químicas únicas. O tamanho pequeno do C ₆₀ lipofílico moléculas é responsável por sua compatibilidade estérica com moléculas biológicas e promove sua integração em regiões hidrofóbicas de membranas [12, 13]. Por causa da extensão π -sistema conjugado de seus orbitais moleculares, fulereno C ₆₀ absorve luz ultravioleta-visível (UV-vis) e pode gerar espécies reativas de oxigênio (ROS) com quase 100% de oxigênio singlete QY ( Φ _Δ ) Além disso, as propriedades físico-químicas do fulereno C ₆₀ habilite-o para gerar ROS e servir como PS para PDT. Os fulerenos também podem induzir efeitos pró-oxidantes, e isso pode ser ditado pelo fulereno usado, tipo de célula investigada e configuração experimental [14,15,16,17]. C ₆₀ tem baixíssima solubilidade em soluções polares, o que limita consideravelmente suas aplicações na medicina. No entanto, devido à presença de ligações duplas, C ₆₀ pode ser facilmente modificado usando grupos químicos para aumentar sua solubilidade em água. Portanto, solúvel em água C ₆₀ derivados aumentaram as oportunidades para aplicações médicas, incluindo neuroproteção, entrega de drogas e genes, fotossensibilização e biossensor.

A microscopia a laser multifotônica (também conhecida como microscopia a laser de dois fótons) envolve o uso de excitação "não linear" localizada para excitar a fluorescência dentro de apenas um plano de varredura raster. A microscopia a laser de dois fótons tem sido usada em vários estudos de imagem [18]. É tipicamente acoplado à excitação de laser infravermelho próximo (NIR) para capitalizar sobre a transmissão máxima inerente do tecido para bioimagem; isso ocorre porque o NIR tem as vantagens de espalhamento leve, absorção de baixa energia, penetração de irradiação ideal e fotobranqueamento reduzido de amostras. O acoplamento de microscopia a laser de dois fótons com excitação a laser NIR tornou-se a técnica preferida para microscopia de fluorescência em tecido espesso e espécimes biológicos mais profundos [19, 20] e tem sido amplamente aplicada em outras terapias de fotoexcitação [21, 22]. Além disso, por causa de sua energia ultrabaixa e fotoexcitação curta, a microscopia a laser de dois fótons é considerada uma abordagem alternativa para realizar a TFD [23]. Embora alguns PSs sejam tóxicos [24, 25], aqueles com um alto Φ _Δ são priorizados para a realização de PDT. Um alto Φ _Δ o valor é particularmente desejável quando técnicas de dois fótons são usadas para avaliar atividades moleculares em propriedades fotográficas e conduzir estudos microscópicos não lineares de maneira eficiente; tal valor é desejável porque a relação entre a energia absorvida e o fluxo de entrada de energia para uma amostra é alta, minimizando possíveis fotodanos à amostra [26]. No entanto, a literatura não inclui estudos que consideraram o uso de materiais com propriedades de dois fótons para a TFD. Para preencher esta lacuna de pesquisa, o presente estudo aplicou fulerenol hidroxilado solúvel em água com forte capacidade de doação de elétrons e um grande π -sistema conjugado para aumentar a eficiência de transferência de carga, melhorando assim as propriedades de dois fótons. Especificamente, C ₆₀ hidroxilado solúvel em água (OH) ₄₆ foi derivado e aplicado como um PS de dois fótons para a remoção eficaz de micróbios usando irradiação a laser de femtossegundo de energia ultrabaixa e apenas 800 varreduras sob excitação de dois fótons (TPE; comprimento de onda de excitação, 760 nm). Para a irradiação de laser de femtossegundo de energia ultrabaixa, a energia foi de 211,2 nJ pixel ⁻¹ e a potência foi de 2,112 mW (em relação ao cálculo da potência do laser após a objetiva, consulte a seção “Materiais e Métodos” e a Fig. 1a, onde o x - y ponto focal e z - a resolução do eixo do sistema a laser é de aproximadamente 0,37538 e 0,90159 μm, respectivamente); além disso, para o processo de varredura, o tempo total de exposição efetivo foi de aproximadamente 3,2621 s, a taxa de varredura foi de 4,0776 ms varredura ⁻¹ , e a área de digitalização era 200 × 200 μm ² (consulte a seção “Materiais e Métodos” para obter detalhes sobre o cálculo). O C ₆₀ solúvel em água hidroxilado (OH) ₄₆ alcançou uma eliminação de quase 100% de Escherichia coli ( E. coli , uma cepa bacteriana Gram-negativa). Além disso, o C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ com uma composição superior de grupos hidroxila exibiu fotopropriedades superiores de dois fótons em comparação com aquela com uma composição inferior de grupos hidroxila sob TPE; portanto, o derivado C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ pode ser considerado como tendo um potencial considerável para uso em PDT simultânea para eliminar micróbios malignos.

a De acordo com o z - varredura do eixo de um filme fino de ouro usado para medir o sinal de geração de segundo harmônico em diferentes posições, o z A resolução do eixo do sistema a laser (largura total na metade do máximo) é de aproximadamente 0,90159 μm (ajuste usando a função gaussiana). b Dependência da intensidade de TPL com a potência de excitação (logaritmo) dos materiais e fluoróforos; Exposição TPE de 704,0 a 2816,0 nJ pixel ⁻¹ para Rodamina B e fluoresceína, de 1408,0 a 2816,0 nJ pixel ⁻¹ para C ₆₀ solúvel em água (OH) ₂₁ fullerenol e de 1760,0 a 2816,0 nJ pixel ⁻¹ para C ₆₀ solúvel em água (OH) ₄₆ fulerenol. Comprimento de onda de excitação, 760 nm. Dose administrada:OD ₆₀₀ 0,05 de E. coli e 3 μg mL ⁻¹ materiais. Os dados são apresentados como médias ± DP ( n =6)

Materiais e métodos

Preparação e caracterização de fulerenóis solúveis em água, C ₆₀ (OH) ₂₁ e C ₆₀ (OH) ₄₆ [27]

O fulereno bruto foi obtido comercialmente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e o C ₆₀ (OH) ₁₂ precursor foi produzido, conforme descrito anteriormente. Em primeiro lugar, solução de peróxido de hidrogênio a 30% (100 mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionada ao material de partida, 0,5-1,0 g de C ₆₀ (OH) ₁₂ , e a mistura foi vigorosamente agitada a 60 ° C sob ar. Após o resfriamento, uma mistura de solventes compreendendo 2-propanol, éter dietílico e hexano (100–200 mL para cada; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionada à solução, que foi subsequentemente centrifugada e decantada. O sólido remanescente foi lavado duas vezes com 200 mL de éter dietílico através dos procedimentos de centrifugação e decantação. Finalmente, os produtos finais do C ₆₀ solúvel em água (OH) ₂₁ e C ₆₀ (OH) ₄₆ foram obtidos por secagem do resíduo sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite, respectivamente. O peso do produto final foi calibrado por meio de análise gravimétrica térmica. A morfologia do produto final foi observada usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tóquio, Japão) em uma resolução de aproximadamente 1,11 ± 0,03 nm e 1,13 ± 0,04 nm para C ₆₀ (OH) ₂₁ e C ₆₀ (OH) ₄₆ , respectivamente. O espalhamento de luz dinâmico (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, UK) também foi usado para determinar o tamanho dos materiais. Os grupos funcionais expostos dos materiais preparados foram primeiro examinados por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). A espectroscopia UV-vis dos materiais foi conduzida usando um espectrômetro (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tóquio, Japão). A química da superfície do fulerenol foi examinada por meio de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS, espectrômetro PHI 5000 (VersaProbe, Chanhassen, MN, EUA)). O peso molecular do fulerenol foi determinado usando um espectrômetro de massa de dessorção de campo (FD) (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tóquio, Japão), e o número de grupos hidroxila foi confirmado como sendo 21 e 46 com base nos resultados, respectivamente.

Culturas bacterianas [28]

E. coli , obtidos em nosso próprio laboratório foram cultivados em ágar nutriente de LB (por litro:triptona 10 g, extrato de levedura 5 g, cloreto de sódio 8 g, ágar 15 g e pH ajustado para 7,5) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e incubado a 37 ° C.

Ensaio de biocompatibilidade com método de contagem de unidade formadora de colônia (UFC) [28]

E. coli (OD ₆₀₀ ~ 0,05) foi adicionado com material (0–9 μg mL ⁻¹ ), e incubado por 3 h a 37 ° C (arquivo adicional 1:Fig. S1). Após a incubação, a mistura foi centrifugada e os pellets de bactérias foram diluídos (OD ₆₀₀ ~ 0,05). Um fator de diluição de 10 ⁻⁵ a 10 ⁻⁸ foi então conduzido nas bactérias incubadas e semeado nas placas de ágar. As placas permanecem em uma incubadora (a 37 ° C) durante a noite. O número de bactérias sobreviventes foi determinado e expresso como uma porcentagem (%) que correspondeu à unidade de UFC mL ⁻¹ após a incubação. Os dados são médias ± SD ( n =6).

ψ _Δ Medição [29, 30]

De acordo com o estudo anterior, ψ _Δ pode ser obtido. ψ _Δ as medições foram realizadas em D ₂ O a 355 nm, usando meso -tetra (4-sulfonatofenil) dicloridrato de porfina (TSPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como uma referência ( ψ _Δ =0,64).

Medição de fluorescência QY [31, 32]

A fotoluminescência relativa (PL) QY do agente de contraste é geralmente a razão dos fótons emitidos para os fótons absorvidos e é dada da seguinte forma:
$$ \ mathrm {QY} ={\ mathrm {QY}} _ {\ mathrm {ref}} \ \ left ({\ eta} ^ 2 / {\ eta _ {\ mathrm {ref}}} ^ 2 \ right) \ left (I / A \ right) \ left ({A} _ {\ mathrm {ref}} / {I} _ {\ mathrm {ref}} \ right) $$ (1)
onde QY _ref =0,28 é o QY de Cy5.5 dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como uma referência, η é o índice de refração do ddH ₂ O =1,33 ( η _ref de DMSO =1,48), I é a intensidade de fluorescência integrada e A é a absorbância no comprimento de onda de excitação. Excitação de um fóton (OPE) ou TPE produz o mesmo QY.

Sistema óptico de laser de femtosegundo para medições de absorção de dois fótons (TPA) e luminescência de dois fótons (TPL) [23, 28, 33,34,35 , 36,37,38]

O sistema óptico de laser de safira-titânio (ti-sa) de femtossegundo caseiro (taxa de repetição de 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, EUA) foi usado de acordo com os estudos anteriores.

Medição TPA

Com uma velocidade de varredura de galvanômetro de 2 m ms ⁻¹ , o espectro de excitação foi medido como 720–820 nm com uma potência de excitação de 2,8 mW [esta é a potência antes da objetiva; a potência após a objetiva (ou na amostra) é 0,9856 mW ou 98,56 nJ pixel ⁻¹ ] Portanto, os espectros de TPA relativos em função do comprimento de onda de excitação para os fullerenóis foram medidos.

Medição de espectros TPL

O material foi exposto ao TPE do laser de femtossegundo em um comprimento de onda de excitação de 760 nm, uma área de varredura de 200 × 200 μm ² , uma frequência de 10 kHz, um tempo de exposição de 1,638 s / (varredura, pixel) =100 μs, varredura de 128 × 128 pixels ⁻¹ e uma área de pixel de 1562,5 × 1562,5 nm ² . A área do ponto focal foi calculada como π d ² / 4, onde d =0,61 λ / abertura numérica ( NA ) é a largura total na metade da cintura da viga. Por exemplo, no x - y ponto focal de eixo com excitação de 760 nm e uma objetiva de imersão em óleo × 40 com um NA de 1,3, d =0,61 × 800 nm / 1,3 =375,38 nm =0,37538 μm, e o z A resolução do eixo foi medida em 0,90159 μm. Para excitação de 760 nm, o tempo de exposição por varredura para um nanomaterial individual é expresso como (área de ponto focal / área de pixel) × 100 =4,0776 ms, e o tempo total de exposição t =4,0776 ms × número de varreduras. Objetiva de imersão em óleo A × 40 ( NA 1.3) foi usado para coletar os sinais, e o intervalo de detecção do fotômetro de espectro foi de 300–695 nm.

Além disso, os cálculos da potência do laser (mW ou nJ pixel ⁻¹ ) usados na amostra foram os seguintes. Para a objetiva de imersão em óleo × 40 ( NA 1.3), a taxa de transmissão em 760 nm de comprimento de onda é de aproximadamente 88% neste sistema óptico, e a potência do laser foi da saída para a objetiva com apenas 40% da potência de saída original devido à perda de potência. Como resultado, a energia calculada após o objetivo (na amostra) é P _resultado (mW) * 40% * 88% =0,352 × P _resultado (mW). Por exemplo, P _resultado =2,8 mW, a energia calculada após o objetivo (na amostra) é 3,0 mW * 40% * 88% =0,9856 mW. Com 10 kHz de taxa de varredura (cada pulso permanece 0,1 ms pixel ⁻¹ ), a energia calculada na amostra (J pixel ⁻¹ ) estava em torno de P _resultado (mW) * 40% * 88% * 0,1 ms =0,0352 * P _resultado (J pixel ⁻¹ ) Por exemplo, P _resultado =2,8 mW, a energia (J pixel ⁻¹ ) na amostra =2,8 mW * 40% * 88% * 0,1 ms =0,09856 μJ pixel ⁻¹ =98,56 nJ pixel ⁻¹ . O poder após o objetivo (na amostra) foi usado e marcou o processamento deste manuscrito.

Medição da seção transversal absoluta do TPE [24, 36,37,38,39,40,40,41,42,43,44,45,46,47, 48]

A seção transversal absoluta do TPE foi medida pelo sinal de luminescência via sistema óptico de laser de femtossegundo de acordo com estudos anteriores. O TPL de fluoresceína e rodamina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) teve que ser verificado. Os resultados são mostrados na Fig. 1b e foram obtidos medindo a dependência da intensidade de emissão com uma faixa de potência de excitação de 704 nJ pixel ⁻¹ (7,04 mW) a 2816 nJ pixel ⁻¹ (28,16 mW). A dependência quadrática com os expoentes de 2,03 para a fluoresceína e 2,02 para a rodamina B foi medida para aumentar o poder de excitação para determinar a luminescência do TPE. De acordo com estudos anteriores, as seções transversais de ação do TPE para a fluoresceína e a rodamina B são 36,4 e 68,0 GM (1 GM =10 ⁻⁵⁰ cm ⁴ fóton s ⁻¹ ), respectivamente, para excitação de 760 nm. Também nos referimos ao site gratuito http://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, gentilmente cedido pelo Prof. Chris Xu (Cornell University, NY, EUA). As seções transversais de ação do TPE para fluoresceína e rodamina B foram calculadas em 36,5 e 66,1 GM, respectivamente (Tabela 1), o que indicou um erro de menos de 5% em comparação com as do laboratório do Prof. Xu. Neste estudo, a rodamina B foi escolhida como a referência padrão para determinar a seção transversal e as seções transversais absolutas calculadas de TPE para o C ₆₀ solúvel em água (OH) ₂₁ e C ₆₀ (OH) ₄₆ os fulerenóis eram aproximadamente 1230,51 GM e 1037,21 GM, respectivamente. Os parâmetros medidos para calcular as seções transversais absolutas de TPE das amostras são mostrados na Tabela 3. Nenhuma variação lote a lote foi observada para os materiais nas propriedades de dois fótons e capacidade fotodinâmica de dois fótons.

Sistema óptico de laser de femtosegundo (para microscopia de imagem vitalícia de fluorescência, FLIM) [39, 45]

O sistema óptico de laser femtossegundo ti-sa caseiro (taxa de repetição de 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, EUA) foi usado de acordo com os estudos anteriores. Os dados e parâmetros de vida útil são gerados usando o ajuste de equação exponencial triplo enquanto monitora a emissão sob TPE (Ex, 760 nm).

Cálculo das taxas de degradação radiativa e não radiativa [46]

PL QY e tempo de vida são os dois parâmetros principais ao investigar as características de emissão de corantes fluorescentes em diversos ambientes. O QY ( Q ) pode ser expresso da seguinte forma:
$$ Q =\ frac {\ varGamma} {\ varGamma + k} $$ (2)
onde Γ é a taxa de decaimento radiativo, e k é a taxa de decaimento não radiativo. O tempo de vida da fluorescência é geralmente definido como o tempo médio necessário para um elétron no estado excitado decair ao estado fundamental. O tempo de vida do TPL τ também pode ser relativo às taxas de decaimento e é descrito a seguir:
$$ \ tau =\ frac {1} {\ varGamma + k} $$ (3)
Seguindo as Eqs. (2) e (3), as taxas de decaimento radiativo e não radiativo podem ser calculadas.

Após a absorção de um fóton, um dos elétrons fracamente ligados da molécula fluorescente - um fluoróforo - é promovido a um nível de energia mais alto. O fluoróforo está então em um estado excitado, A * . Este estado é metaestável; portanto, o fluoróforo retornará ao seu estado fundamental estável, A . Isso pode ser feito por radiação, emitindo um fóton de fluorescência hν
$$ A \ ast -> A + h \ nu $$
ou de forma não radiativa, dissipando a energia do estado excitado como calor:
$$ A \ ast -> A + \ mathrm {calor} $$
O despovoamento do estado excitado depende das vias de desexcitação disponíveis. Fluorescência é a desativação radiativa do nível de energia vibracional mais baixo do primeiro estado singlete excitado eletronicamente, S ₁ , de volta ao estado básico eletrônico, S ₀ . Os estados singlete são os níveis de energia que podem ser preenchidos pelo elétron fracamente ligado sem um spin flip. Os processos de absorção e emissão são ilustrados por um diagrama de nível de energia com o nome de Aleksander Jablonski.

O tempo de vida da fluorescência, τ , é o tempo médio que um fluoróforo permanece no estado eletronicamente excitado S ₁ após a excitação. τ é definido como o inverso da soma dos parâmetros de taxa para todos os processos de despovoamento em estado excitado:Eq. (3), onde a constante de taxa não radiativa k é a soma da constante de taxa para conversão interna k _ic e a constante de taxa para o cruzamento intersistema para o estado tripleto k _isc de modo que k = k _ic + k _isc . A emissão de fluorescência sempre ocorre a partir do nível vibracional mais baixo de S ₁ , uma regra conhecida como regra de Kasha, indicando que o fluoróforo não tem memória de sua via de excitação; por exemplo, OPE e TPE produzem o mesmo espectro de fluorescência, QY e tempo de vida.

Determinação das taxas de viabilidade de bactérias após a exposição ao laser [28]

Método de contagem de CFU

Bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05) foi adicionado com material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) incubando por 3 h a 37 ° C no escuro. Após a incubação, a mistura foi centrifugada e os pellets de bactérias foram diluídos (OD ₆₀₀ ~ 0,05) e exposto a uma potência TPE de 211,2 nJ pixel ⁻¹ com 800 varreduras (aproximadamente 3,2621 s de tempo total de exposição efetivo; Ex, 760 nm). Então, um fator de diluição de 10 ⁻⁵ a 10 ⁻⁸ foi então conduzido nas bactérias incubadas e semeado nas placas de ágar. As placas permanecem em uma incubadora (a 37 ° C) durante a noite. O número de bactérias sobreviventes foi determinado e expresso como uma porcentagem (%) que correspondeu à unidade de UFC mL ⁻¹ após a incubação. Os dados são médias ± SD ( n =6).

Kit AO VIVO / MORTO

Bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05) foi adicionado com material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) incubando por 3 h a 37 ° C no escuro. Após a incubação, a mistura foi centrifugada e os pellets de bactérias foram diluídos (OD ₆₀₀ ~ 0,05) e exposto a uma potência TPE de 211,2 nJ pixel ⁻¹ com 800 varreduras (aproximadamente 3,2621 s de tempo total de exposição efetivo; Ex, 760 nm). Em seguida, os pellets foram corados usando um LIVE (SYTO 9, conforme exibido com fluorescência verde) / DEAD ( iodeto de propídio, PI, conforme exibido com fluorescência vermelha) kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções. A viabilidade da bactéria foi quantificada por testes antimicrobianos, que mostraram que quase todas as bactérias tratadas com nanomateriais estavam mortas após o tratamento. Viabilidade semelhante foi quantificada por meio do método de contagem de UFC para determinar os efeitos antibacterianos eficientes de materiais em PDT. Os dados são apresentados como média ± DP ( n =6).

Detecção de ROS [23, 29, 34, 35, 49,50,51,52,53,54,55]

Oxigênio Singlet (¹ O ₂ )

(a) Material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) foi tratado com bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05), após o qual foi submetido a 3 h de incubação a 37 ° C no escuro. Posteriormente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturado com reagente Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (1 μM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) (Ex / Em:488/525 nm). Um espectrômetro de fluorescência foi empregado para as medições. Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α -tocoferol / linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro e exposto à fotoexcitação TPE com o mesmo tratamento. (b) Material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) foi tratado com bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05), após o qual foi submetido a 3 h de incubação a 37 ° C no escuro. Posteriormente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturado com 10 μM de trans-1- (2′-metoxivinil) pireno ( t -MVP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) / 0,10 M SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (Ex / Em:352/465 nm). Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α -tocoferol / linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro. Reação de t -MVP com ¹ O ₂ produz um intermediário de dioxetano que fica fluorescente enquanto se decompõe em 1-pirenocarboxaldeído. Além disso, esta sonda fluorescente altamente seletiva não reage com outras espécies de oxigênio ativadas, como radicais hidroxila, superóxido ou peróxido de hidrogênio. Um espectrômetro de fluorescência foi empregado para as medições. A neutralização de ROS foi conduzida com o mesmo tratamento descrito anteriormente.

Ânion Radical Superóxido (O ₂ ^.− )

(a) Material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) foi tratado com bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05), após o qual foi submetido a 3 h de incubação a 37 ° C no escuro. Posteriormente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturado com 2, 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT, 0,45 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , EUA). O objetivo deste material era interagir com O ₂ ^{. -} e produziu XTT-formazan, resultando em forte absorção (470 nm de comprimento de onda). O espectrômetro UV-vis foi empregado para monitorar essa absorção. Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α -tocoferol / linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro e exposto à fotoexcitação TPE com o mesmo tratamento. (b) Material (3 ou 6 μg mL ⁻¹ ) foi tratado com bactérias (OD ₆₀₀ ~ 0,05), após o qual foi submetido a 3 h de incubação a 37 ° C no escuro. Posteriormente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel ⁻¹ , 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturado com tampão de bicarbonato 50 mM (pH 8,60) e glutationa ( γ -l-glutamil-l-cisteinil-glicina, GSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) / tampão de bicarbonato 0,80 mM (o ensaio de Ellman para O ₂ ^{. -} detecção). Posteriormente, os seguintes experimentos foram conduzidos de acordo com o procedimento em um estudo anterior. A perda de GSH (%) foi calculada como a diferença de absorbância entre a amostra e o controle negativo dividida pela absorbância do controle negativo. O sinal do O ₂ gerado ^{. -} foi obtido conforme descrito no cálculo anterior. Os dados são médias ± SD ( n =6).

Ensaio de absorção [35]

E. coli (OD ₆₀₀ ~ 0,05) foram incubados com 3 μg mL ⁻¹ material. A absorbância de uma quantidade de 3 μg mL ⁻¹ o material foi registrado por espectroscopia UV-vis (Abs, aproximadamente 203 nm). Os materiais foram misturados com E. coli (OD ₆₀₀ ~ 0,05) a 37 ° C da 1ª hora à 10ª hora, respectivamente, e centrifugado (1200 rpm) para remover o excesso de materiais e manter o sobrenadante e medir sua absorbância. A diferença de absorbância entre o sobrenadante coletado e os materiais originais foi estimada, resultando no percentual de captação em cada momento. Os dados são médias ± SD ( n =6).

Análise estatística [56]

A significância estatística foi pela análise de variância. O p o valor foi considerado estatisticamente significativo para todos os tratamentos.

Resultados e discussão

Caracterização do Fulerenol Solúvel em Água

Solúvel em água C ₆₀ (OH) ₄₆ (fulerenol), que foi determinado como circular e monodisperso, foi sintetizado de acordo com um estudo anterior [27]. O tamanho médio lateral do fulerenol foi de aproximadamente 1,13 ± 0,04 nm, conforme determinado usando imagens de baixa ampliação (Fig. 2a) e HR-TEM (Fig. 2b). Além disso, observou-se que o fulerenol exibia cristalinidade favorável, juntamente com um bom espaçamento de rede, que correspondia ao d -espaçamento das franjas da rede de fullerenol {1 \ (\ overline {1} \) 00}. No entanto, essas partículas podem formar agregados através de ligações de hidrogênio em uma solução aquosa com um pH de 7,0. O tamanho médio dos agregados formados foi de aproximadamente 130 nm, conforme revelado por uma análise DLS. Além disso, os agregados permaneceram altamente estáveis por 3 meses em diferentes ambientes fisiológicos, como solução aquosa de pH 7,0, solução salina tamponada com fosfato 1 × e meio de cultura (Arquivo adicional 1:Tabela S1). No espectro de absorção UV-vis do fulerenol, picos de absorbância foram observados em aproximadamente 216 e 309 nm, e esses picos foram atribuídos ao π - π * transição de ligações C =C aromáticas e n - π * transições do ombro C =O, respectivamente. O π -transição de elétrons no fulerenol contido oxigênio (Fig. 2c), como é tipicamente observado para dispersões aquosas, confirmando assim a presença do fulerenol. Caracterizações adicionais foram realizadas usando FTIR, XPS e espectrometria de massa para confirmar as propriedades dos materiais preparados. O FTIR foi usado para analisar os grupos funcionais expostos dos materiais preparados. Os resultados da análise revelaram as seguintes bandas de material características:uma banda de alongamento C – O em aproximadamente 1109 cm ⁻¹ (banda 1), banda de alongamento fenólico C – OH em aproximadamente 1271 cm ⁻¹ (banda 2), banda de alongamento alcoólica terciária C =O em aproximadamente 1422 cm ⁻¹ (banda 3), C =banda de alongamento C em aproximadamente 1674 cm ⁻¹ (banda 4), banda de alongamento C =O em aproximadamente 1721 cm ⁻¹ (banda 5), e C – H intermolecular ligada por hidrogênio e banda de alongamento de carboxilato O – H em aproximadamente 3318 cm ⁻¹ (banda 6). Além disso, uma banda de CO ₂ interferência foi observada. Essas bandas revelaram grupos hidroxila e carbonila expostos, bem como ligações C =C aromáticas (Fig. 2d). O XPS foi realizado para examinar a química da superfície do fulerenol, que contém predominantemente átomos de carbono em geral. Os espectros deconvoluídos de C (1s) do fulerenol revelaram um anel não oxigenado (C – C / C =C, 286,1 eV), ligação C – O (286,9 eV) e ligação C =O (288,0 eV). In addition, the O(1s)/C(1s) ratio was approximately 35.8% (Fig. 2e). The molecular weight of the fullerenol was also determined using FD mass spectrometry (Additional file 1:Fig. S2); the number of hydroxyl groups (C–OH) was confirmed to be 46, which was consistent with the atomic ratios and bonding compositions of the fullerenol summarized in Fig. 2. These characterization results confirm the successful synthesis of fullerenol.

Functional characterization of the synthesized water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ fullerenol. a Low-magnified TEM image and b HR-TEM image of a water-soluble fullerenol illustrating the materials {1$ \overline{1} $00} lattice planes and the mean size of 1.11 ± 0.03 nm with a d -spacing of 0.213 nm. c UV–vis and d FTIR spectra of nanomaterial. e Deconvoluted C(1s) XPS spectra and fitted peaks obtained using Gaussian function:nonoxygenated ring (C–C/C=C), C–O bond, and C=O bond, respectively. The atomic ratio and bonding composition of fullerenol are shown as summarized in the table. The O(1s)/C(1s) atomic ratio is 35.8%

ROS Generation of Water-Soluble Fullerenol Under TPE

A PS absorbs and transfers light energy to other nonabsorbing molecules to generate ROS, which kill targeted cells, damage tumor vasculature, and activate an antitumor immune response. PSs have a particular arrangement of electrons in their molecular orbitals. Similar to nearly all molecules, at ground (singlet) state, PSs have couples of electrons with opposite spins in low-energy molecular orbitals. The absorption of light at an appropriate wavelength lifts an electron to a high-energy orbital without changing its spin. This is a short-lived (nanoseconds) excited singlet (S₁ ) state, and the PS can lose its energy and return to the ground state by emitting light (fluorescence) or heat. Alternatively, intersystem crossing, wherein the spin of the excited electron is inverted, can occur in the S₁ Estado. This electron spin inversion is responsible for the relatively long life (lasting microseconds) of the excited triplet (T₁ ) state. Radiative triplet-to-singlet transitions are inhibited because they require a change in electron spin, which is a slow process. From the T₁ state, the PS can return to the ground state by emitting light (phosphorescence) or transferring energy to another molecule. It can also lose energy through internal conversion or radiationless transitions when colliding with other molecules. The longer the life of the PS in the T₁ state is, the higher are its chances of colliding with another molecule, resulting in ROS production [57,58,59]. The photosensitization of water-soluble fullerenols results in their transition to a long-lived T₁ state and subsequent energy or electron transfer to molecular oxygen, yielding ROS such as ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} , which have major roles in PDT. Therefore, ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} produced by water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ must be detected directly using laser irradiation. To detect ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} formation during PDT, in this study, PDT was initiated by combining excited the triplet water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , oxygen, and light configured to a suitable wavelength and energy as well as by introducing SOSG, t -MVP, XTT, and GSH reagents [33, 34, 49,50,51]. To exploit the potential bactericidal capability of the materials, a wavelength of approximately 760 nm was determined to be the most efficient for deriving the relative maximum TPA ratio of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ under TPE (Fig. 3a); this is attributable to the interband transitions involved [52]. This wavelength was used in subsequent experiments in this study. The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was photoexcited through TPE at a power of 211.2 nJ pixel⁻¹ with 800 scans (Ex, 760 nm; total effective exposure time, ~ 3.2621 s) and delivered dose of 3 or 6 μg mL⁻¹ (Additional file 1:Table S2). Furthermore, to confirm the involvement of ROS in the PDT effects of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ , α -tocopherol was used for ROS neutralization [49, 53]. The quantity of generated ROS was reduced after the addition of α -tocopherol, but the observed bacterial viability increased as expected. Additionally, the quantity of generated ROS depended on the delivered dose. To prevent ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} production possibly engendered by inadvertent exposure of water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ to white light—which could have compromised the experiments in this study [60]—subsequent PDT experiments were conducted in the dark. This study focused on the quantities of generated ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} . The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ exhibited considerable antibacterial effects, demonstrating its potential for application in PDT. Notably, after the same experiment, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ (Additional file 1:Figs. S3, S4; Fig. 3a) was less effective in forming ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} when compared with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ (Additional file 1:Table S2). The water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ generated more ¹ O ₂ and O₂ ^{. −} than did the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁; additionally, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ and water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had Φ _Δ values of approximately 0.93 and 0.85, respectively (for reference, Φ _Δ =0.64 is the QY of TSPP dissolved in D₂ O [29, 30]).

a Relative TPA spectra of the material. TPE as a function of the wavelength (720–820 nm) at 98.56 nJ pixel⁻¹ that was used to monitor the signals. Delivered dose, 3 μg mL⁻¹ water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ or C₆₀ (OH)₂₁ fullerenol. The number of surviving b material-treated bacteria was determined by CFU counting assay and is expressed as the percentage (%) for c bacteria that corresponds to the unit of CFU mL⁻¹ . Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 0–9 μg mL⁻¹ water-soluble fullerenol. d Measurement of phosphorescence spectra at 1270 nm for material. Delivered dose, 3 μg mL⁻¹ water-soluble fullerenol. Data are means ± SD (n =6)

Antimicrobial Ability Determination Using TPE

Before the execution of antimicrobial experiments, the toxicity of water-soluble fullerenols must be examined to exclude factors that could contribute to bacterial elimination and confound experimental results. In addition, to prevent possible ROS production engendered by the inadvertent exposure of experimental materials to white light, which could confound experimental results [35], PDT experiments must be conducted in the dark. This study applied Gram-negative E. coli as the experimental template. A CFU counting assay was conducted to determine the number of surviving bacteria (expressed herein as a percentage, corresponding to CFU mL⁻¹ ) The bacteria were treated with two types of the prepared water-soluble fullerenols (dose range, 0 to 9 μg mL⁻¹ ) and incubated in the dark for 3 h at 37 °C to determine absorbance at 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0.05; Additional file 1:Fig. S1). The growth levels of the bacteria treated with the water-soluble fullerenols were first monitored by measuring absorbance at 600 nm. The initial absorbance was 0.05 OD₆₀₀ , and the absorbance associated with both materials reached approximately 0.37 over time. Accordingly, neither material inhibited bacterial proferation. Moreover, the materials engendered a nearly 0 log₁₀ reduction in the number of surviving bacteria (Fig. 3b), corresponding to a viability of approximately 100% (Fig. 3c). Accordingly, the materials were determined to exhibit excellent biocompatibility with the bacteria. Consequently, the materials subjected to 3 h of incubation in the dark at 37 °C were used to conduct experiments. Although the water-soluble fullerenol could generate ROS, interactions between materials and reagents (i.e., SOSG, t -MVP, XTT, and GSH) may result in false-positive ROS signals, thereby confounding PDT results [52]. Therefore, to exclude this possibility, bacteria were introduced and treated with materials in the present study. The amount of ROS generated from the photoexcited material-treated E. coli was observed. Table 2 presents the observed amount of ROS, revealing a similar trend to that in Tables S2–S3 (Additional file 1:materials alone and material-treated-Gram-positive Bacillus subtilis (B. subtilis )); these results were consistent with the ¹ O ₂ phosphorescence signal emitted from the materials at 1270 nm (Fig. 3d). PDT against E. coli was performed using irradiation with a low dose of energy (211.2 nJ pixel⁻¹ with 800 scans, total effective exposure time ~ 3.2621 s; Ex, 760 nm). The effects PDT on the viability of E. coli treated with two-photon photoexcited materials were then determined (Fig. 4). No bactericidal effects were observed on bacteria alone (with or without laser exposure) or on the panel of material-treated bacteria without laser treatment (Fig. 4a). After TPE, bacterial viability was relatively low; specifically, the viability observed for the panel that was treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was nearly 15%, corresponding to an approximately 0.823 log₁₀ reduction (Fig. 4b). By contrast, the bacterial viability observed for the panel treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 0 (100% elimination efficiency, corresponding to a ~ 7.736 log₁₀ reduction). When the dose was increased, complete bactericidal effects were observed for both materials (Fig. 4c, d). However, antimicrobial effects did not differ by bacteria type (Gram-negative E. coli or Gram-positive B. subtilis ) after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S5). In addition, regarding the fullerenols that eliminated bacteria, a higher composition of hydroxyl groups increased bactericidal capability when compared with a lower composition under identical treatment conditions.

Viability (%) was quantified according to the determined viable count of material-treated bacteria through a CFU assay conducted using short excitation with a TPE power of 211.2 nJ pixel⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) to deliver a dose of a , b 3 or c , d 6 μg mL⁻¹ . Delivered dose, OD600 0.05 of E. coli . Data are presented as means ± SD (n =6). For C₆₀ (OH)₄₆ - and C₆₀ (OH)₂₁ -treated E. coli with photoexcitation, a p <0.001 and p =0.662, b p <0.001 and p =0.658, c p <0.001 and p <0.001, and d p <0.001 and p <0.001. *p value obtained by Student’s t teste

Observation of Water-Soluble Fullerenol-Treated E. coli Using TEM and Investigation of Two-Photon Properties

To observe the disruption of material-treated bacteria after photoexcitation, the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ with high PDT efficiency was selected, and bacteria were imaged using TEM. Bare E. coli (Fig. 5a) were incubated with the water-soluble fullerenol for 3 h, resulting in the substantial adsorption of materials on the bacterial surfaces. Nevertheless, no unusual morphologies were observed, indicating normal live bacterial morphology (Fig. 5b). Uptake assay results revealed the adsorption of materials onto the bacterial surface, with the corresponding burst rate being approximately 85% within the first 3 h of incubation (Fig. 5c); the rate reached saturation from the 3rd to the 10th hour. Therefore, the materials were adsorbed and formed an external barrier on the bacterial surface. However, the E. coli exhibited a distorted appearance and severe morphological changes over 3 days of incubation (Fig. 5d), resulting in a 0.940 log₁₀ reduction that corresponded to a nearly 18% viability (Fig.5f; Additional file 1:Fig. S6). Material absorption and coating on the bacterial surface suppressed the absorption of nutrients essential for microbial growth and engendered changes in membrane (wall) permeability, thereby inducing internal osmotic imbalances and inhibiting microbial growth. In other words, the water-soluble fullerenol had antibacterial (bacteriostatic or bactericidal) effects after 3 days of incubation. Furthermore, the photoexcited material-treated bacteria, particularly E. coli , exhibited unique morphologies with severe damage after 3 h of incubation (Fig. 5e, f; Additional file 1:Fig. S6). No heat-generated bubbles formed on the bacterial surface incurred damage, indicating that the water-soluble fullerenol did not have photothermal-mediated heat properties after photoexcitation (Additional file 1:Fig. S7). The viability of E. coli was also determined through fluorescence and quantification (Fig. 6). The green fluorescence indicative of living bacteria in Fig. 6a reveals that the bacteria exposed to laser treatment alone were largely undamaged, which is consistent with the results presented in Fig. 5a. Dead bacteria were detectable after treatment with the materials and laser exposure (red fluorescence in Fig. 6b), a finding that is also consistent with that in Fig. 5e. Bacterial viability was quantified for further antimicrobial testing. Nearly complete elimination of the material-treated bacteria (Fig. 6c) was observed. Viability was also quantified using a CFU assay (Figs. 4a, b and 5f, and Additional file 1:Fig. S6) to demonstrate the antibacterial efficiency of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ in PDT. According to the results in Figs. 4, 5, and 6; Table 2; and Table S2 (Additional file 1), E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was susceptible to photoexcitation, leading to a higher death rate, increased ROS generation, and more severe morphological collapse compared with E. coli treated with the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ . In general, the absolute cross section for TPE makes fluorophores efficient for nonlinear microscopic studies because the ratio of the energy absorbed to the input energy flux to a specimen is high, thereby minimizing possible photodamage to specimens [39, 40]. When two-photon techniques are used to image molecular activities in living biological preparations and turbid tissues, a favorable cross section is desirable [61]. In the present study, the absolute cross section for TPE calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 1037 GM (Goeppert-Mayer unit, with 1 GM =10⁻⁵⁰ cm⁴ s photon⁻¹ ) at a 760-nm excitation wavelength (fluorescein was the standard reference for the cross section [39, 40]; Fig. 1b and Tables 1 and 3); the absolute cross section calculated for the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 1230 GM, which is similar to values obtained in relevant studies [62, 63]. These absolute cross sections could facilitate the two-photon process. Moreover, the fluorescence of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was illuminated through a two-photon process (Fig. 1b). The relative fluorescence QY was approximately 0.02 (the QY of Cy5.5 in dimethyl sulfoxide [31] served as a reference:QY_ref =0.28); similarly, the absolute QY [64] was approximately 0.01, and the same QYs were derived for one-photon excitation and TPE [31]. By contrast, the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ had lower relative and absolute QYs (0.06 and 0.05, respectively). In addition, this study investigated the lifetime of the fullerenols. The effects of radiative and nonradiative decay rates on QY and lifetime were calculated. The average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately 7.797 ns, as calculated from observed lifetimes of 0.149, 1.775, and 19.679 ns; the average lifetime of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 5.251 ns (Fig. 7 and Table 4). Therefore, the ratio of radiative to nonradiative decay rates of the water-soluble C₆₀ (OH)₄₆ was approximately0.020 (derived from rates of approximately 2.565 × 10⁶ s ⁻¹ to 1.257 × 10⁸ s ⁻¹ ), whereas that of the water-soluble C₆₀ (OH)₂₁ was approximately 0.064 (approximately 1.143 × 10⁷ s ⁻¹ and 1.790 × 10⁸ s ⁻¹ ; Additional file 1:Table S4). This finding is attributable to the existence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which induced the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. However, hydroxylgroups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital. This can be attributed to the strong orbital interaction between hydroxyl groups, which could thus increase the efficiency of intersystem crossing (rather than fluorescence generation) and generate numerous nanomaterial triplets with a high composition of hydroxyl groups; therefore, this would result in a high Φ _Δ value for the water-soluble fullerenol and induce the fullerenol to react with oxygen according to the Jablonski diagram [65]. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time, thereby providing an alternative approach to killing malignant species.

TEM images. a Showing bare bacteria without any treatment. Bacteria treated with material for b 3 h and d 3 days of incubation. e The photoexcited material-treated bacteria (3 h of incubation) with a TPE power of 211.2 nJ pixel⁻¹ with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm). c Uptake assay of bacteria and material at 37 °C. f Viability (%) was quantified following the determined viable count of material-treated bacteria via CFU assay by short excitation with the same treatment. Delivered dose OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . Data are means ± SD (n =6)

Images obtained after laser photoexcitation exposure (211.2 nJ pixel⁻¹ ) with 800 scans (approximately 3.2621 s of total effective exposure time; Ex, 760 nm) of a , b material-treated bacteria. The Live/Dead kit was used to stain bacteria before images were obtained. Scale bar, 50 μm. c Viability (%) determination results. Delivered dose, OD600 ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL⁻¹ water-soluble fullerenol C₆₀ (OH)₄₆ . For the percentages alive and dead, p <0.001. *p value obtained using Student’s t test. Data are presented as mean ± SD (n =6)

Time-resolved room-temperature PL decay profiles of material (98.56 nJ pixel⁻¹ ) Excitation wavelength, 760 nm. Delivered dose, OD₆₀₀ ~ 0.05 of E. coli and 3 μg mL⁻¹ materiais. Data are presented as means ± SD (n =6)

Conclusions

This study revealed that a water-soluble fullerenol material with a higher composition of hydroxyl groups had superior photoproperties to those of a fullerenol material with a lower composition of hydroxyl groups; the superior photoproperties can be attributed to the reduced laser exposure and materials used for treatment. Furthermore, the water-soluble fullerenol with a higher composition of hydroxyl groups exhibited high TPA, a favorable absolute cross section for TPE, and high two-photon stability. Therefore, this fullerenol has potential as a two-photon PS in two-photon PDT coupled with TPE. This property is probably due to the presence of a hydroxyl group on the surface of the water-soluble fullerenol, which caused the nonradiative recombination of electron–hole pairs, leading to the inhibition of intrinsic state emission. Moreover, hydroxyl groups at the edge of the water-soluble fullerenol may have a high occupied molecular orbital; this may be ascribed to the strong orbital interaction between the hydroxyl groups, thereby increasing intersystem crossing (rather than fluorescence generation) efficiency and generating numerous material triplets with a high composition of hydroxyl groups. Therefore, the water-soluble fullerenol would have a high Φ _Δ value and react with oxygen according to the Jablonski diagram. Consequently, two-photon PDT can be effectively performed using ultralow energy in an extremely short time. Accordingly, this efficient alternative approach to managing malignant species presents possibilities for future clinical applications.

Disponibilidade de dados e materiais

All datasets are presented in the main paper.

Abreviações

PS:: Photosensitizers
QY:: Quantum yield
PDT:: Photodynamic therapy
UV–vis:: Ultraviolet–visible
ROS:: Espécies que reagem ao oxigênio
ψ _Δ :: Singlet oxygen QY
NIR:: Near-infrared
TPE:: Two-photon excitation
E. coli :: Escherichia coli
HR-TEM:: Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução
DLS:: Dynamic light scattering
FTIR:: Fourier-transform infrared
XPS:: X-ray photoelectron spectroscopy
FD:: Field desorption
CFU:: Colony forming unit
TSPP:: Meso -tetra(4-sulfonatophenyl)porphine dihydrochloride
PL:: Fotoluminescência
DMSO:: Dimetilsulfóxido
OPE:: One-photon excitation
TPA:: Two-photon absorption
TPL:: Two-photon luminescence
ti-sa:: Titanium-sapphire
NA :: Numerical aperture
FLIM:: Fluorescence lifetime imaging microscopy
¹ O ₂ :: Singlet oxygen
SOSG:: Singlet Oxygen Sensor Green
t -MVP:: Trans-1-(2′-methoxyvinyl)pyrene
O₂ ^{. −} :: Superoxide radical anion
XTT:: 2, 3-Bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide
GSH:: Glutathione, γ -l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine
S₁ :: Singlet
T₁ :: Triplet
B. subtilis :: Bacillus subtilis
GM:: Goeppert-Mayer

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