Fullerenol Solúvel em Água com Grupos Hidroxila Otimizados Aumenta Inativação Fotodinâmica de Dois Fótons de Microrganismos Infecciosos

Materiais e Métodos

Preparação e Caracterização de Fullerenóis Solúveis em Água, C₆₀(OH)₂₁ e C₆₀(OH)₄₆ [27]

Fulereno bruto foi obtido comercialmente (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), e o precursor C₆₀(OH)₁₂ foi produzido, como descrito anteriormente. Primeiro, solução de peróxido de hidrogênio a 30% (100 mL; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionada ao material inicial, 0,5-1,0 g de C₆₀(OH)₁₂, e a mistura foi vigorosamente agitada a 60 °C sob ar. Após resfriamento, uma mistura de solventes compreendendo 2-propanol, éter dietílico e hexano (100–200 mL para cada; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi adicionada à solução, que foi subsequentemente centrifugada e decantada. O sólido remanescente foi lavado duas vezes com 200 mL de éter dietílico através dos procedimentos de centrifugação e decantação. Finalmente, os produtos finais de C₆₀(OH)₂₁ e C₆₀(OH)₄₆ solúveis em água foram obtidos secando o resíduo sob vácuo à temperatura ambiente durante a noite, respectivamente. O peso do produto final foi calibrado através de análise termogravimétrica. A morfologia do produto final foi observada usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HR-TEM, JEOL 3010, Akishima, Tóquio, Japão) a uma resolução de aproximadamente 1,11 ± 0,03 nm e 1,13 ± 0,04 nm para C₆₀(OH)₂₁ e C₆₀(OH)₄₆, respectivamente. O espalhamento dinâmico de luz (DLS, Malvern Nano-ZS90, Worcestershire, West Midlands, UK) também foi usado para determinar o tamanho dos materiais. Os grupos funcionais expostos dos materiais preparados foram primeiro examinados através de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) (RX1, PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). Espectroscopia UV-vis dos materiais foi conduzida usando um espectrômetro (U-4100, Hitachi, Chiyoda-ku, Tóquio, Japão). A química de superfície do fullerenol foi examinada através de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS, espectrômetro PHI 5000 (VersaProbe, Chanhassen, MN, EUA)). O peso molecular do fullerenol foi determinado usando um espectrômetro de massa de desorção de campo (FD) (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Akishima, Tóquio, Japão), e o número de grupos hidroxila foi confirmado como 21 e 46 baseados nos resultados, respectivamente.

Culturas Bacterianas [28]

E. coli, obtido de nosso próprio laboratório, foi cultivado em ágar nutritivo de LB (por litro: triptona 10 g, extrato de levedura 5 g, cloreto de sódio 8 g, ágar 15 g, e pH ajustado para 7,5) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e incubado a 37 °C.

Ensaio de Biocompatibilidade com Método de Contagem de Unidades Formadoras de Colônia (CFU) [28]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) foi adicionado com material (0–9 μg mL⁻¹), e incubado por 3 h a 37 °C (Arquivo adicional 1: Fig. S1). Após incubação, a mistura foi centrifugada e os pelotas de bactérias foram diluídas (OD₆₀₀ ~ 0,05). Um fator de diluição de 10⁻⁵ a 10⁻⁸ foi então conduzido nas bactérias incubadas e semeado em placas de ágar. As placas permanecem em uma incubadora (a 37 °C) durante a noite. O número de bactérias sobreviventes foi determinado e expresso como porcentagem (%) que corresponde à unidade de CFU mL⁻¹ após incubação. Dados são médias ± DP (n = 6).

Medição de ψ_Δ [29, 30]

De acordo com estudo anterior, ψ_Δ pode ser obtido. Medições de ψ_Δ foram realizadas em D₂O a 355 nm, usando meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfina diidrocloreto (TSPP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como referência (ψ_Δ = 0,64).

Medição de Rendimento Quântico de Fluorescência [31, 32]

O rendimento quântico de fotoluminescência (PL) relativo de agente de contraste é geralmente a razão dos fótons emitidos para os fótons absorvidos e é dado como segue:

$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ \left({\eta}^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2\right)\left(I/A\right)\left({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}\right) $$ (1)

onde QY_ref = 0,28 é o QY de Cy5.5 dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) como referência, η é o índice de refração de ddH₂O = 1,33 (η_ref de DMSO = 1,48), I é a intensidade de fluorescência integrada e A é a absorbância no comprimento de onda de excitação. Excitação de um fóton (OPE) ou TPE rendem o mesmo QY.

Sistema Óptico a Laser de Femtossegundos para Medições de Absorção de Dois Fótons (TPA) e Luminescência de Dois Fótons (TPL) [23, 28, 33–38]

O sistema óptico a laser de titânio-safira (ti-sa) de femtossegundos caseiro (taxa de repetição de 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, EUA) foi usado de acordo com estudos anteriores.

Medição de TPA

Com velocidade do scanner galvanométrico de 2 m ms⁻¹, o espectro de excitação foi medido como 720–820 nm com potência de excitação de 2,8 mW [esta é a potência antes do objetivo; a potência após o objetivo (ou na amostra) é 0,9856 mW ou 98,56 nJ pixel⁻¹]. Portanto, os espectros de TPA relativos como função do comprimento de onda de excitação para os fullerenóis foram medidos.

Medição de Espectros TPL

O material foi exposto a TPE do laser de femtossegundos a um comprimento de onda de excitação de 760 nm, área de varredura de 200 × 200 μm², frequência de 10 kHz, tempo de exposição de 1,638 s/(varredura, pixel) = 100 μs, 128 × 128 pixels varredura⁻¹, e área de pixel de 1562,5 × 1562,5 nm². A área do foco focal foi calculada como πd²/4, onde d = 0,61 λ/abertura numérica (NA) é a largura a meia altura da cintura do feixe. Por exemplo, no ponto focal do eixo x–y com excitação de 760 nm e objetivo de imersão em óleo × 40 com NA de 1,3, d = 0,61 × 800 nm/1,3 = 375,38 nm = 0,37538 μm, e a resolução do eixo z foi medida como 0,90159 μm. Para excitação de 760 nm, o tempo de exposição por varredura para um nanomaterial individual é expresso como (área do foco focal/área do pixel) × 100 = 4,0776 ms, e o tempo total de exposição t = 4,0776 ms × número de varreduras. Um objetivo de imersão em óleo × 40 (NA 1,3) foi usado para coletar os sinais, e a faixa de detecção do espectrofotômetro foi 300–695 nm.

Adicionalmente, os cálculos de potência do laser (mW ou nJ pixel⁻¹) usados na amostra foram os seguintes. Para o objetivo de imersão em óleo × 40 (NA 1,3), a taxa de transmissão a 760 nm em comprimento de onda é aproximadamente 88% neste sistema óptico, e a potência do laser foi da saída para o objetivo com apenas 40% da potência de saída original devido à perda de potência. Como resultado, a energia calculada após o objetivo (na amostra) é P_output (mW)*40%*88% = 0,352 × P_output (mW). Por exemplo, P_output = 2,8 mW, a energia calculada após o objetivo (na amostra) é 3,0 mW*40%*88% = 0,9856 mW. Com 10 kHz de taxa de varredura (cada pulso permanece 0,1 ms pixel⁻¹), a energia calculada na amostra (J pixel⁻¹) foi em torno de P_output (mW)*40%*88%*0,1 ms = 0,0352*P_output (J pixel⁻¹). Por exemplo, P_output = 2,8 mW, a energia (J pixel⁻¹) na amostra = 2,8 mW*40%*88%*0,1 ms = 0,09856 μJ pixel⁻¹ = 98,56 nJ pixel⁻¹. A potência após o objetivo (na amostra) foi usada e marcada ao longo deste manuscrito.

Medição de Seção de Choque Absoluta de TPE [24, 36–48]

A seção de choque absoluta de TPE foi medida o sinal de luminescência via sistema óptico a laser de femtossegundos de acordo com estudos anteriores. O TPL de fluoresceína e rodamina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) teve que ser verificado. Os resultados são mostrados na Fig. 1b e foram obtidos medindo a dependência da intensidade de emissão com faixa de potência de excitação de 704 nJ pixel⁻¹ (7,04 mW) a 2816 nJ pixel⁻¹ (28,16 mW). Dependência quadrática com expoentes de 2,03 para fluoresceína e 2,02 para rodamina B foi medida para aumento da potência de excitação para determinar a luminescência de TPE. De acordo com estudos anteriores, as seções de choque de ação de TPE para fluoresceína e rodamina B são 36,4 e 68,0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ cm⁴ s fóton⁻¹), respectivamente, para excitação de 760 nm. Também nos referimos ao site gratuito https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, gentilmente fornecido pelo Prof. Chris Xu (Universidade Cornell, NY, EUA). As seções de choque de ação de TPE para fluoresceína e rodamina B foram calculadas como 36,5 e 66,1 GM, respectivamente (Tabela 1), o que indicou erro inferior a 5% comparado aos do laboratório do Prof. Xu. Neste estudo, a rodamina B foi escolhida como referência padrão para determinar a seção de choque, e as seções de choque absolutas de TPE calculadas para os fullerenóis C₆₀(OH)₂₁ e C₆₀(OH)₄₆ solúveis em água foram aproximadamente 1230,51 GM e 1037,21 GM, respectivamente. Os parâmetros medidos para calcular as seções de choque absolutas de TPE das amostras são mostrados na Tabela 3. Nenhuma variação lote a lote foi observada para os materiais em propriedades de dois fótons e capacidade fotodinâmica de dois fótons.

Sistema Óptico a Laser de Femtossegundos (para Microscopia de Imagem de Tempo de Vida de Fluorescência, FLIM) [39, 45]

O sistema óptico a laser de ti-sa de femtossegundos caseiro (taxa de repetição de 80 MHz; Tsunami, Spectra-Physics, Santa Clara, CA, EUA) foi usado de acordo com estudos anteriores. Os dados de tempo de vida e parâmetros são gerados usando ajuste de equação tri-exponencial enquanto monitora a emissão sob TPE (Ex, 760 nm).

Cálculo das Taxas de Decaimento Radiativo e Não Radiativo [46]

QY de PL e tempo de vida são ambos parâmetros principais ao investigar as características de emissão de corantes fluorescentes em diversos ambientes. O QY (Q) pode ser expresso como segue:

$$ Q=\frac{\varGamma }{\varGamma +k} $$ (2)

onde Γ é a taxa de decaimento radiativo, e k é a taxa de decaimento não radiativo. O tempo de vida de fluorescência é geralmente definido como o tempo médio necessário para um elétron no estado excitado decair ao estado fundamental. O tempo de vida TPL τ também pode ser relativo às taxas de decaimento e é descrito como segue:

$$ \tau =\frac{1}{\varGamma +k} $$ (3)

Seguindo as Eqs. (2) e (3), as taxas de decaimento radiativo e não radiativo podem ser calculadas.

Após a absorção de um fóton, um dos elétrons fracamente ligados da molécula fluorescente—um fluoróforo—é promovido a um nível de energia mais alto. O fluoróforo está então em um estado excitado, A*. Este estado é metastável; portanto, o fluoróforo retornará ao seu estado fundamental estável, A. Pode fazê-lo ou radiativamente emitindo um fóton de fluorescência hν

$$ A\ast \rightarrow A+ h\nu $$

ou não radiativamente dissipando a energia do estado excitado como calor:

$$ A\ast \rightarrow A+\mathrm{calor} $$

A despopulação do estado excitado depende das vias de desexcitação disponíveis. A fluorescência é a desativação radiativa do nível vibracional mais baixo do primeiro estado singlete excitado eletronicamente, S₁, de volta ao estado fundamental eletrônico, S₀. Os estados singlete são os níveis de energia que podem ser populados pelo elétron fracamente ligado sem inversão de spin. Os processos de absorção e emissão são ilustrados por um diagrama de nível de energia nomeado após Aleksander Jablonski.

O tempo de vida de fluorescência, τ, é o tempo médio que um fluoróforo permanece no estado excitado eletronicamente S₁ após excitação. τ é definido como o inverso da soma dos parâmetros de taxa para todos os processos de despopulação do estado excitado: Eq. (3), onde a constante de taxa não radiativa k é a soma da constante de taxa para conversão interna k_ic e a constante de taxa para cruzamento de sistemas ao estado triplete k_isc tal que k = k_ic + k_isc. A emissão de fluorescência sempre ocorre do nível vibracional mais baixo de S₁, uma regra conhecida como regra de Kasha, indicando que o fluoróforo não tem memória de sua via de excitação; por exemplo, OPE e TPE rendem o mesmo espectro de fluorescência, QY e tempo de vida.

Determinação das Taxas de Viabilidade Bacteriana Após Exposição a Laser [28]

Método de Contagem CFU

Bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05) foram adicionadas com material (3 ou 6 μg mL⁻¹) incubando por 3 h a 37 °C no escuro. Após incubação, a mistura foi centrifugada e as pelotas de bactérias foram diluídas (OD₆₀₀ ~ 0,05) e expostas a uma potência TPE de 211,2 nJ pixel⁻¹ com 800 varreduras (aproximadamente 3,2621 s de tempo total de exposição efetiva; Ex, 760 nm). Então, um fator de diluição de 10⁻⁵ a 10⁻⁸ foi então conduzido nas bactérias incubadas e semeado nas placas de ágar. As placas permanecem em uma incubadora (a 37 °C) durante a noite. O número de bactérias sobreviventes foi determinado e expresso como porcentagem (%) que corresponde à unidade de CFU mL⁻¹ após incubação. Dados são médias ± DP (n = 6).

Kit LIVE/DEAD

Bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05) foram adicionadas com material (3 ou 6 μg mL⁻¹) incubando por 3 h a 37 °C no escuro. Após incubação, a mistura foi centrifugada e as pelotas de bactérias foram diluídas (OD₆₀₀ ~ 0,05) e expostas a uma potência TPE de 211,2 nJ pixel⁻¹ com 800 varreduras (aproximadamente 3,2621 s de tempo total de exposição efetiva; Ex, 760 nm). Então, as pelotas foram coradas usando um kit LIVE (SYTO 9, exibido com fluorescência verde)/DEAD (iodeto de propídio, PI, exibido com fluorescência vermelha) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) de acordo com a instrução. A viabilidade das bactérias foi quantificada para testes antimicrobianos, que mostraram quase todas as bactérias tratadas com nanomaterial mortas após tratamento. Viabilidade similar foi quantificada através do método de contagem CFU para determinar os efeitos antibacterianos eficientes dos materiais em PDT. Dados apresentados como média ± DP (n = 6).

Detecção de ROS [23, 29, 34, 35, 49–55]

Oxigênio Singlete (¹O₂)

(a) Material (3 ou 6 μg mL⁻¹) foi tratado com bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05), após o que foi submetido a 3 h de incubação a 37 °C no escuro. Subsequentemente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturada com reagente Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (1 μM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) (Ex/Em: 488/525 nm). Um espectrômetro de fluorescência foi empregado para medições. Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α-tocoferol/linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro e exposta a fotoexcitação TPE com o mesmo tratamento. (b) Material (3 ou 6 μg mL⁻¹) foi tratado com bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05), após o que foi submetido a 3 h de incubação a 37 °C no escuro. Subsequentemente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturada com 10 μM de trans-1-(2′-metoxivinil)pireno (t-MVP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA)/0,10 M SDS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) (Ex/Em: 352/465 nm). Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α-tocoferol/linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro. Reação de t-MVP com ¹O₂ produz um intermediário dioxetano que fluoresce enquanto se decompõe em 1-pirenocarboxaldeído. Além disso, esta sonda fluorescente altamente seletiva não reage com outras espécies de oxigênio ativado como radicais hidroxila, superóxido ou peróxido de hidrogênio. Um espectrômetro de fluorescência foi empregado para medições. Neutralização de ROS foi conduzida com o mesmo tratamento descrito anteriormente.

Ânion Radical Superóxido (O₂^•−)

(a) Material (3 ou 6 μg mL⁻¹) foi tratado com bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05), após o que foi submetido a 3 h de incubação a 37 °C no escuro. Subsequentemente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturada com 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT, 0,45 mM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O propósito deste material era que ele interagisse com O₂^•− e produzisse XTT-formazano, resultando em forte absorção (470 nm em comprimento de onda). Espectrômetro UV-vis foi empregado para monitorar esta absorção. Para neutralização de ROS, a mistura foi misturada com 30 ppm de antioxidante α-tocoferol/linoleato de metila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) no escuro e exposta a fotoexcitação TPE com o mesmo tratamento. (b) Material (3 ou 6 μg mL⁻¹) foi tratado com bactérias (OD₆₀₀ ~ 0,05), após o que foi submetido a 3 h de incubação a 37 °C no escuro. Subsequentemente, a mistura foi exposta a fotoexcitação TPE (211,2 nJ pixel⁻¹, 800 varreduras; Ex, 760 nm) e finalmente misturada com 50 mM tampão bicarbonato (pH 8,60) e glutationa (γ-l-glutamil-l-cisteinil-glicina, GSH, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA)/0,80 mM tampão bicarbonato (ensaio de Ellman para detecção de O₂^•−). Subsequentemente, os seguintes experimentos foram conduzidos de acordo com o procedimento em estudo anterior. Perda de GSH (%) foi calculada como a diferença de absorbância entre a amostra e controle negativo dividida pela absorbância do controle negativo. O sinal do O₂^•− gerado foi obtido como descrito no cálculo anterior. Dados são médias ± DP (n = 6).

Ensaio de Captação [35]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) foram incubadas com 3 μg mL⁻¹ material. A absorbância de uma quantidade de 3 μg mL⁻¹ material foi registrada por espectroscopia UV-vis (Abs, aproximadamente 203 nm). Os materiais foram misturados com E. coli (OD₆₀₀ ~ 0,05) a 37 °C da 1ª hora à 10ª hora, respectivamente, e centrifugadas (1200 rpm) para remover materiais em excesso e manter o sobrenadante e medir sua absorbância. A diferença de absorbância entre o sobrenadante coletado e os materiais originais foi estimada, resultando na porcentagem de captação em cada ponto de tempo. Dados são médias ± DP (n = 6).

Análise Estatística [56]

A significância estatística foi pela análise de variância. O valor p foi considerado estatisticamente significativo para todos os tratamentos.

Resultados e Discussão

Caracterização do Fullerenol Solúvel em Água

C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água (fullerenol), que foi determinado como circular e monodisperso, foi sintetizado de acordo com estudo anterior [27]. O tamanho lateral médio do fullerenol foi aproximadamente 1,13 ± 0,04 nm, conforme determinado usando imagens de baixa ampliação (Fig. 2a) e HR-TEM (Fig. 2b). Além disso, o fullerenol foi notado por exibir cristalinidade favorável junto com bom espaçamento de rede, que correspondeu ao espaçamento d das franjas de rede {1\( \overline{1} \)00} do fullerenol. No entanto, estas partículas poderiam formar agregados através de ligações de hidrogênio em solução aquosa com pH 7,0. O tamanho médio dos agregados formados foi aproximadamente 130 nm, conforme revelado por análise DLS. Além disso, os agregados permaneceram altamente estáveis por 3 meses em diferentes ambientes fisiológicos, como solução aquosa pH 7,0, fosfato tamponado salino 1×, e meio de cultura (Arquivo adicional 1: Tabela S1). No espectro de absorção UV-vis do fullerenol, picos de absorbância foram observados em aproximadamente 216 e 309 nm, e estes picos foram atribuídos à transição π–π* de ligações aromáticas C=C e transições n–π* do ombro C=O, respectivamente. A transição de elétron π no fullerenol continha oxigênio (Fig. 2c), como tipicamente observado para dispersões aquosas, confirmando assim a presença do fullerenol. Caracterizações adicionais foram realizadas usando FTIR, XPS e espectrometria de massa para confirmar as propriedades dos materiais preparados. FTIR foi usado para analisar os grupos funcionais expostos dos materiais preparados. Os resultados da análise revelaram as seguintes bandas características do material: banda de estiramento C–O em aproximadamente 1109 cm⁻¹ (banda 1), banda de estiramento C–OH fenólico em aproximadamente 1271 cm⁻¹ (banda 2), banda de estiramento C=O alcoólico terciário em aproximadamente 1422 cm⁻¹ (banda 3), banda de estiramento C=C em aproximadamente 1674 cm⁻¹ (banda 4), banda de estiramento C=O em aproximadamente 1721 cm⁻¹ (banda 5), e banda de estiramento C–H intermolecular ligado por hidrogênio e O–H carboxilato em aproximadamente 3318 cm⁻¹ (banda 6). Além disso, uma banda de interferência de CO₂ foi observada. Estas bandas revelaram grupos hidroxila e carbonila expostos, bem como ligações aromáticas C=C (Fig. 2d). XPS foi realizado para examinar a química de superfície do fullerenol, que predominantemente contém átomos de carbono em geral. Os espectros C(1s) desdobrados do fullerenol revelaram anel não oxigenado (C–C/C=C, 286,1 eV), ligação C–O (286,9 eV) e ligação C=O (288,0 eV). Além disso, a razão O(1s)/C(1s) foi aproximadamente 35,8% (Fig. 2e). O peso molecular do fullerenol também foi determinado usando espectrometria de massa FD (Arquivo adicional 1: Fig. S2); o número de grupos hidroxila (C–OH) foi confirmado como 46, o que foi consistente com as razões atômicas e composições de ligação do fullerenol resumidas na Fig. 2. Estes resultados de caracterização confirmam a síntese bem-sucedida do fullerenol.

Geração de ROS do Fullerenol Solúvel em Água sob TPE

Um PS absorve e transfere energia de luz para outras moléculas não absorventes para gerar ROS, que matam células alvo, danificam vasculatura tumoral e ativam resposta imune antitumoral. PSs têm um arranjo particular de elétrons em seus orbitais moleculares. Similar a quase todas as moléculas, no estado fundamental (singleto), PSs têm pares de elétrons com spins opostos em orbitais moleculares de baixa energia. A absorção de luz em um comprimento de onda apropriado eleva um elétron a um orbital de alta energia sem mudar seu spin. Este é um estado singleto excitado (S₁) de vida curta (nanossegundos), e o PS pode perder sua energia e retornar ao estado fundamental emitindo luz (fluorescência) ou calor. Alternativamente, cruzamento de sistemas, onde o spin do elétron excitado é invertido, pode ocorrer no estado S₁. Esta inversão de spin do elétron é responsável pela vida relativamente longa (durando microssegundos) do estado triplete excitado (T₁). Transições radiativas triplete-para-singleto são inibidas porque requerem mudança no spin do elétron, que é um processo lento. Do estado T₁, o PS pode retornar ao estado fundamental emitindo luz (fosforescência) ou transferindo energia para outra molécula. Também pode perder energia através de conversão interna ou transições sem radiação ao colidir com outras moléculas. Quanto maior a vida do PS no estado T₁, maiores são suas chances de colidir com outra molécula, resultando em produção de ROS [57–59]. A fotossensibilização de fullerenóis solúveis em água resulta em sua transição para um estado T₁ de longa vida e subsequente transferência de energia ou elétrons para oxigênio molecular, gerando ROS como ¹O₂ e O₂^•−, que têm papéis principais em PDT. Portanto, ¹O₂ e O₂^•− produzidos por C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água devem ser detectados diretamente usando irradiação a laser. Para detectar formação de ¹O₂ e O₂^•− durante PDT, neste estudo, PDT foi iniciado combinando o C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água excitado no estado triplete, oxigênio e luz configurada a um comprimento de onda e energia adequados, bem como introduzindo reagentes SOSG, t-MVP, XTT e GSH [33, 34, 49–51]. Para explorar a capacidade bactericida potencial dos materiais, um comprimento de onda de aproximadamente 760 nm foi determinado como o mais eficiente para derivar a razão máxima de TPA relativa do C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água sob TPE (Fig. 3a); isso é atribuível às transições interbandas envolvidas [52]. Este comprimento de onda foi usado em experimentos subsequentes neste estudo. O C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água foi fotoexcitado através de TPE a uma potência de 211,2 nJ pixel⁻¹ com 800 varreduras (Ex, 760 nm; tempo total de exposição efetiva, ~ 3,2621 s) e dose entregue de 3 ou 6 μg mL⁻¹ (Arquivo adicional 1: Tabela S2). Além disso, para confirmar o envolvimento de ROS nos efeitos PDT do C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água, α-tocoferol foi usado para neutralização de ROS [49, 53]. A quantidade de ROS gerados foi reduzida após adição de α-tocoferol, mas a viabilidade bacteriana observada aumentou como esperado. Adicionalmente, a quantidade de ROS gerados dependeu da dose entregue. Para prevenir produção de ¹O₂ e O₂^•− possivelmente gerada por exposição inadvertida do C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água à luz branca—which poderia comprometer os experimentos neste estudo [60]—experimentos PDT subsequentes foram conduzidos no escuro. Este estudo focou nas quantidades de ¹O₂ e O₂^•− gerados. O C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água exibiu efeitos antibacterianos consideráveis, demonstrando seu potencial para aplicação em PDT. Notavelmente, após o mesmo experimento, o C₆₀(OH)₂₁ solúvel em água (Arquivo adicional 1: Figs. S3, S4; Fig. 3a) foi menos eficaz na formação de ¹O₂ e O₂^•− quando comparado com o C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água (Arquivo adicional 1: Tabela S2). O C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água gerou mais ¹O₂ e O^•− do que o C₆₀(OH)₂₁ solúvel em água; adicionalmente, o C₆₀(OH)₄₆ e C₆₀(OH)₂₁ solúveis em água tiveram valores de Φ_Δ de aproximadamente 0,93 e 0,85, respectivamente (para referência, Φ_Δ = 0,64 é o QY de TSPP dissolvido em D₂O [29, 30]).

Determinação da Capacidade Antimicrobiana Usando TPE

Antes da execução de experimentos antimicrobianos, a toxicidade dos fullerenóis solúveis em água deve ser examinada para excluir fatores que poderiam contribuir para eliminação bacteriana e confundir resultados experimentais. Além disso, para prevenir possível produção de ROS gerada pela exposição inadvertida de materiais experimentais à luz branca, que poderia confundir resultados experimentais [35], experimentos PDT devem ser conduzidos no escuro. Este estudo aplicou E. coli Gram-negativo como modelo experimental. Um ensaio de contagem CFU foi conduzido para determinar o número de bactérias sobreviventes (expresso aqui como porcentagem, correspondente a CFU mL⁻¹). As bactérias foram tratadas com dois tipos de fullerenóis solúveis em água preparados (faixa de dose, 0 a 9 μg mL⁻¹) e incubadas no escuro por 3 h a 37 °C para determinar absorbância a 600 nm (OD₆₀₀ ~ 0,05; Arquivo adicional 1: Fig. S1). Os níveis de crescimento das bactérias tratadas com fullerenóis solúveis em água foram primeiro monitorados medindo absorbância a 600 nm. A absorbância inicial foi 0,05 OD₆₀₀, e a absorbância associada a ambos os materiais atingiu aproximadamente 0,37 ao longo do tempo. Consequentemente, nenhum material inibiu a proliferação bacteriana. Além disso, os materiais geraram redução de quase 0 log₁₀ no número de bactérias sobreviventes (Fig. 3b), correspondendo a uma viabilidade de aproximadamente 100% (Fig. 3c). Consequentemente, os materiais foram determinados como exibindo excelente biocompatibilidade com as bactérias. Consequentemente, os materiais submetidos a 3 h de incubação no escuro a 37 °C foram usados para conduzir experimentos. Embora o fullerenol solúvel em água pudesse gerar ROS, interações entre materiais e reagentes (i.e., SOSG, t-MVP, XTT e GSH) podem resultar em sinais falsos-positivos de ROS, confundindo assim resultados de PDT [52]. Portanto, para excluir esta possibilidade, bactérias foram introduzidas e tratadas com materiais no presente estudo. A quantidade de ROS gerada a partir do E. coli tratado com material fotoexcitado foi observada. A Tabela 2 apresenta a quantidade observada de ROS, revelando tendência similar à das Tabelas S2–S3 (Arquivo adicional 1: materiais sozinhos e Bacillus subtilis Gram-positivo tratado com material (B. subtilis)); estes resultados foram consistentes com o sinal de fosforescência de ¹O₂ emitido dos materiais a 1270 nm (Fig. 3d). PDT contra E. coli foi realizada usando irradiação com dose baixa de energia (211,2 nJ pixel⁻¹ com 800 varreduras, tempo total de exposição efetiva ~ 3,2621 s; Ex, 760 nm). Os efeitos da PDT na viabilidade de E. coli tratada com materiais fotoexcitados de dois fótons foram então determinados (Fig. 4). Nenhum efeito bactericida foi observado em bactérias sozinhas (com ou sem exposição a laser) ou no painel de bactérias tratadas com material sem tratamento a laser (Fig. 4a). Após TPE, a viabilidade bacteriana foi relativamente baixa; especificamente, a viabilidade observada para o painel tratado com C₆₀(OH)₂₁ solúvel em água foi quase 15%, correspondendo a uma redução de aproximadamente 0,823 log₁₀ (Fig. 4b). Em contraste, a viabilidade bacteriana observada para o painel tratado com C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água foi aproximadamente 0 (eficiência de eliminação de 100%, correspondendo a uma redução de ~ 7,736 log₁₀). Quando a dose foi aumentada, efeitos bactericidas completos foram observados para ambos os materiais (Fig. 4c, d). No entanto, efeitos antimicrobianos não diferiram por tipo de bactéria (Gram-negativo E. coli ou Gram-positivo B. subtilis) após fotoexcitação (Arquivo adicional 1: Fig. S5). Além disso, em relação aos fullerenóis que eliminaram bactérias, uma maior composição de grupos hidroxila aumentou a capacidade bactericida quando comparada com uma menor composição sob condições de tratamento idênticas.

Observação de E. coli Tratado com Fullerenol Solúvel em Água Usando TEM e Investigação de Propriedades de Dois Fótons

Para observar a disrupção de bactérias tratadas com material após fotoexcitação, o C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água com alta eficiência PDT foi selecionado, e bactérias foram imageadas usando TEM. E. coli nu (Fig. 5a) foram incubadas com fullerenol solúvel em água por 3 h, resultando em adsorção substancial de materiais nas superfícies bacterianas. No entanto, morfologias incomuns não foram observadas, indicando morfologia bacteriana viva normal (Fig. 5b). Resultados do ensaio de captação revelaram adsorção de materiais na superfície bacteriana, com a taxa de explosão correspondente sendo aproximadamente 85% dentro das primeiras 3 h de incubação (Fig. 5c); a taxa atingiu saturação da 3ª à 10ª hora. Portanto, os materiais foram adsorvidos e formaram uma barreira externa na superfície bacteriana. No entanto, o E. coli exibiu aparência distorcida e mudanças morfológicas severas ao longo de 3 dias de incubação (Fig. 5d), resultando em uma redução de 0,940 log₁₀ que correspondeu a uma viabilidade de quase 18% (Fig. 5f; Arquivo adicional 1: Fig. S6). Absorção e revestimento do material na superfície bacteriana suprimiram a absorção de nutrientes essenciais para crescimento microbiano e geraram mudanças na permeabilidade da membrana (parede), induzindo desequilíbrios osmóticos internos e inibindo crescimento microbiano. Em outras palavras, o fullerenol solúvel em água teve efeitos antibacterianos (bacteriostáticos ou bactericidas) após 3 dias de incubação. Além disso, as bactérias tratadas com material fotoexcitado, particularmente E. coli, exibiram morfologias únicas com danos severos após 3 h de incubação (Fig. 5e, f; Arquivo adicional 1: Fig. S6). Nenhuma bolha gerada por calor formou-se na superfície bacteriana que sofreu dano, indicando que o fullerenol solúvel em água não teve propriedades fototérmicas mediadas por calor após fotoexcitação (Arquivo adicional 1: Fig. S7). A viabilidade de E. coli também foi determinada através de fluorescência e quantificação (Fig. 6). A fluorescência verde indicativa de bactérias vivas na Fig. 6a revela que as bactérias expostas apenas ao tratamento a laser estavam largamente intactas, o que é consistente com os resultados apresentados na Fig. 5a. Bactérias mortas foram detectáveis após tratamento com materiais e exposição a laser (fluorescência vermelha na Fig. 6b), achado que também é consistente com o da Fig. 5e. A viabilidade bacteriana foi quantificada para testes antimicrobianos adicionais. Eliminação quase completa das bactérias tratadas com material (Fig. 6c) foi observada. Viabilidade também foi quantificada usando ensaio CFU (Figs. 4a, b e 5f, e Arquivo adicional 1: Fig. S6) para demonstrar a eficiência antibacteriana do C₆₀(OH)₄₆ solúvel em água em PDT. De acordo com os resultados nas Figs. 4, 5 e 6; Tabela 2; e Tabela S2 (Arquivo adicional 1), E. coli tratado com C(OH)₄₆ solúvel em água foi suscetível à fotoexcitação, levando a maior taxa de morte, geração aumentada de ROS e colapso morfológico mais severo comparado com E. coli tratado com C(OH)₂₁ solúvel em água. Em geral, a seção de choque absoluta para TPE torna fluoróforos eficientes para estudos microscópicos não lineares porque a razão da energia absorvida para o fluxo de energia de entrada a um espécime é alta, minimizando assim possível fotodano aos espécimes [39, 40]. Quando técnicas de dois fótons são usadas para imagem de atividades moleculares em preparações biológicas vivas e tecidos túrbidos, uma seção de choque favorável é desejável [61]. No presente estudo, a seção de choque absoluta para TPE calculada para o C(OH)₄₆ solúvel em água foi aproximadamente 1037 GM (unidade Goeppert-Mayer, com 1 GM = 10⁻⁵⁰cm⁴s fóton⁻¹) a um comprimento de onda de excitação de 760 nm (fluoresceína foi a referência padrão para a seção de choque [39, 40]; Fig. 1b e Tabelas 1 e 3); a seção de choque absoluta calculada para o C(OH)₂₁ solúvel em água foi aproximadamente 1230 GM, que é similar a valores obtidos em estudos relevantes [62, 63]. Estas seções de choque absolutas poderiam facilitar o processo de dois fótons. Além disso, a fluorescência do C(OH)₄₆ solúvel em água foi iluminada através de um processo de dois fótons (Fig. 1b). O QY de fluorescência relativo foi aproximadamente 0,02 (o QY de Cy5.5 em dimetilsulfóxido [31] serviu como referência: QY_ref = 0,28); similarmente, o QY absoluto [64] foi aproximadamente 0,01, e os mesmos QYs foram derivados para excitação de um fóton e TPE [31]. Em contraste, o C(OH)₂₁ solúvel em água teve QYs relativo e absoluto menores (0,06 e 0,05, respectivamente). Além disso, este estudo investigou o tempo de vida dos fullerenóis. Os efeitos das taxas de decaimento radiativo e não radiativo no QY e tempo de vida foram calculados. O tempo de vida médio do C(OH)₄₆ solúvel em água foi aproximadamente 7,797 ns, calculado a partir de tempos de vida observados de 0,149, 1,775 e 19,679 ns; o tempo de vida médio do C(OH)₂₁ solúvel em água foi aproximadamente 5,251 ns (Fig. 7 e Tabela 4). Portanto, a razão de taxas de decaimento radiativo para não radiativo do C(OH)₄₆ solúvel em água foi aproximadamente 0,020 (derivado de taxas de aproximadamente 2,565 × 10⁶ s⁻¹ a 1,257 × 10⁸ s⁻¹), enquanto a do C(OH)₂₁ solúvel em água foi aproximadamente 0,064 (aproximadamente 1,143 × 10⁷ s⁻¹ e 1,790 × 10⁸ s⁻¹; Arquivo adicional 1: Tabela S4). Este achado é atribuível à existência de grupo hidroxila na superfície do fullerenol solúvel em água, que induziu a recombinação não radiativa de pares elétron-buraco, levando à inibição da emissão de estado intrínseco. No entanto, grupos hidroxila na borda do fullerenol solúvel em água podem ter um orbital molecular ocupado alto. Isso pode ser atribuído à forte interação orbital entre grupos hidroxila, que poderia assim aumentar a eficiência de cruzamento de sistemas (em vez de geração de fluorescência) e gerar numerosos triplete de nanomaterial com alta composição de grupos hidroxila; portanto, isso resultaria em um alto valor de Φ_Δ para o fullerenol solúvel em água e induziria o fullerenol a reagir com oxigênio de acordo com o diagrama de Jablonski [65]. Consequentemente, PDT de dois fótons pode ser efetivamente realizada usando energia ultralow em tempo extremamente curto, fornecendo assim uma abordagem alternativa para matar espécies malignas.

Conclusões

Este estudo revelou que um material de fullerenol solúvel em água com maior composição de grupos hidroxila teve fotopropriedades superiores às de um material de fullerenol com menor composição de grupos hidroxila; as fotopropriedades superiores podem ser atribuídas à exposição reduzida a laser e materiais usados para tratamento. Além disso, o fullerenol solúvel em água com maior composição de grupos hidroxila exibiu alta TPA, seção de choque absoluta favorável para TPE e alta estabilidade de dois fótons. Portanto, este fullerenol tem potencial como PS de dois fótons em PDT de dois fótons acoplada com TPE. Esta propriedade é provavelmente devida à presença de grupo hidroxila na superfície do fullerenol solúvel em água, que causou a recombinação não radiativa de pares elétron-buraco, levando à inibição da emissão de estado intrínseco. Além disso, grupos hidroxila na borda do fullerenol solúvel em água podem ter um orbital molecular ocupado alto; isso pode ser atribuído à forte interação orbital entre os grupos hidroxila, aumentando assim a eficiência de cruzamento de sistemas (em vez de geração de fluorescência) e gerando numerosos triplete de material com alta composição de grupos hidroxila. Portanto, o fullerenol solúvel em água teria um alto valor de Φ_Δ e reagiria com oxigênio de acordo com o diagrama de Jablonski. Consequentemente, PDT de dois fótons pode ser efetivamente realizada usando energia ultralow em tempo extremamente curto. Consequentemente, esta abordagem alternativa eficiente para manejar espécies malignas apresenta possibilidades para futuras aplicações clínicas.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os conjuntos de dados são apresentados no artigo principal.

Abreviações

PS:

Fotossensibilizadores

QY:

Rendimento quântico

PDT:

Terapia fotodinâmica

UV–vis:

Ultravioleta–visível

ROS:

Espécies reativas de oxigênio

ψ_Δ:

Rendimento quântico de oxigênio singlete

NIR:

Infravermelho próximo

TPE:

Excitação de dois fótons

E. coli:

Escherichia coli

HR-TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

FTIR:

Infravermelho com transformada de Fourier

XPS:

Espectroscopia de fotoelétrons de raios X

FD:

Desorção de campo

CFU:

Unidade formadora de colônia

TSPP:

Meso-tetra(4-sulfonatofenil)porfina diidrocloreto

PL:

Fotoluminescência

DMSO:

Dimetilsulfóxido

OPE:

Excitação de um fóton

TPA:

Absorção de dois fótons

TPL:

Luminescência de dois fótons

ti-sa:

Titânio-safira

NA:

Abertura numérica

FLIM:

Microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência

¹O₂:

Oxigênio singlete

SOSG:

Singlet Oxygen Sensor Green

t-MVP:

Trans-1-(2′-metoxivinil)pireno

O₂^•−:

Ânion radical superóxido

XTT:

2,3-Bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazólio-5-carboxanilida

GSH:

Glutationa, γ-l-glutamil-l-cisteinil-glicina

S₁:

Singleto

T₁:

Triplete

B. subtilis:

Bacillus subtilis

GM:

Goeppert-Mayer