Nanocomplexos de óxido de grafeno modificado com folato funcionalizado / PEI siRNA para terapia gênica direcionada do câncer de ovário

Resumo

A terapia gênica está emergindo como um método válido para o tratamento do câncer de ovário, incluindo pequenos RNA interferentes (siRNA). Embora seja tão poderoso, poucos sistemas de direcionamento de entrega de genes eficientes prejudicaram seriamente o desenvolvimento da terapia gênica. Neste estudo, sintetizamos um novo vetor gênico PEG-GO-PEI-FA por óxido de grafeno funcionalizado (GO), no qual o ácido fólico (FA) pode se ligar especificamente ao receptor de folato (FR), que é superexpresso no câncer de ovário. As caracterizações dos nanocomplexos foram avaliadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS), microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A capacidade e estabilidade de condensação do siRNA foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose. A eficiência de captação celular e a capacidade de escape lisossomal em células de câncer de ovário foram investigadas por microscopia confocal de varredura a laser. Além disso, a biossegurança celular do sistema e a inibição da tolerabilidade do siRNA foram avaliadas pelo ensaio CCK-8. O tamanho dos nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA foi de 216,1 ± 2,457 nm, exibindo citotoxicidade leve em células de câncer de ovário. Com alta eficiência de captação, o PEG-GO-PEI-FA pode escapar do lisossoma rapidamente e liberar o gene. Além disso, PEG-GO-PEI-FA / siRNA pode inibir efetivamente o crescimento de células cancerígenas de ovário. Em geral, o PEG-GO-PEI-FA / siRNA pode oferecer uma estratégia promissora para entrega de siRNA no tratamento de carcinoma de ovário FR-positivo ou tumores semelhantes.

Introdução

O câncer de ovário é a principal causa de morte ginecológica no mundo e geralmente está associado a maus resultados clínicos devido às dificuldades de diagnóstico e terapia precoces [1,2,3]. Infelizmente, os agentes quimioterápicos convencionais apresentam limitações inerentes, como distribuição não específica, baixa biodisponibilidade, rápida depuração do sangue e baixa solubilidade em ambientes fisiológicos [4]. Nas últimas décadas, a terapia gênica tem sido investigada como uma abordagem potencial para o tratamento de várias doenças genéticas, incluindo cânceres [5,6,7,8]. No entanto, a falta de um transportador de entrega de genes seguro, altamente eficiente e seletivo tem impedido seu avanço para a utilidade clínica. Atualmente, existem duas categorias de vetores de genes:vetores virais e não virais. Embora os vetores virais tenham mostrado alta eficiência de transfecção, várias desvantagens limitam sua aplicação clínica, por exemplo, reações imunológicas inflamatórias graves e o risco de recombinação com vírus de tipo selvagem [9, 10]. Em contraste, os vetores não virais têm uma extensa capacidade de entrega, baixa imunogenicidade e flexibilidade estrutural, tornando-os excelentes alternativas aos vetores virais [11,12,13]. Com o rápido desenvolvimento da nanotecnologia, muitas nanopartículas foram exploradas para uso potencial como transportadores de entrega de genes [14, 15]. Aqui, este trabalho projetou um novo vetor não viral PEG-GO-PEI-FA que pode ser entregue de forma eficiente aos tecidos tumorais.

O óxido de grafeno (GO) é o derivado da grafite que é produzido pela oxidação em várias etapas, ultra-som e purificação da grafite [16]. A superfície GO contém grupos epóxi, hidroxila e carboxila [17]. Os grupos funcionais de oxigênio em sua superfície conferem ao GO excelente biocompatibilidade que o permite formar uma suspensão estável em água e solventes orgânicos, facilitando modificações químicas e funcionalização [18, 19]. Portanto, o GO tem sido amplamente utilizado para terapia fototérmica do câncer, entrega de drogas e genes e biossensores [20,21,22]. O polietilenoglicol (PEG) é um material seguro, não tóxico e biodegradável; foi aprovado pela Food and Drug Administration dos EUA como um portador de drogas hidrofílicas [23]. A funcionalização do GO com PEG pode melhorar a estabilidade sob condições fisiológicas, estender o tempo de ciclo do nanomaterial GO no corpo e melhorar a farmacocinética do nanomaterial GO para melhor direcionamento do tumor [24, 25]. A polietilenoimina (PEI) tornou-se um padrão ouro de vetores não virais devido à sua alta eficiência de transfecção em várias linhas celulares [26]. No entanto, PEI apresenta citotoxicidade severa e baixa biocompatibilidade, limitando assim suas aplicações clínicas. Neste estudo, observamos uma diminuição significativa na citotoxicidade quando o PEI foi enxertado na superfície do GO. O receptor de folato está se expressando em excesso na superfície de várias células cancerosas, especialmente em células cancerosas ovarianas, tanto antes quanto após a quimioterapia [27]. Para a entrega de genes direcionados, as moléculas de ácido fólico foram ligadas covalentemente com GO para direcionar os receptores de folato.

No geral, o objetivo principal do presente estudo foi explorar um novo sistema de entrega de genes baseado em GO para aumentar a utilidade da terapia gênica baseada em siRNA para câncer de ovário. O PEG-GO-PEI-FA carregado positivamente obtido pode ser carregado com siRNA para entrega do gene. Sua síntese, caracterização, internalização celular eficaz e efeito anticâncer in vitro foram analisados ​​usando várias técnicas. Além disso, a segurança deste sistema também foi avaliada in vitro.

Materiais e métodos

Materiais

O óxido de grafeno foi obtido da Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Ácido fólico (FA), N -hidroxissuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram adquiridos a Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). PEI 25K ramificado, PEG (MW =2000), agarose e cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etil carbodiimida (EDC · HCL) foram adquiridos de Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Solução tamponada com fosfato (PBS), solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) e todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Xangai, China). Todos os outros produtos químicos eram de qualidade reagente. Meio RPMI-1640 (Gibco), soro fetal bovino (FBS) (Gibco), tripsina (Gibco) e tampão TAE 20 × foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). O kit8 de contagem de células (CCK-8) foi adquirido de Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, 4% paraformaldeído, 4′-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e reagentes de transfecção Lipofectamine 2000 foram adquiridos de Invitrogen Co. Ltd. (China). A sonda de fluorescência Dil (número Cat:C1036) foi adquirida de Beyotime Co. Ltd. Anti-PLK1 (PLK1-homo-581) ARN de interferência curta (siRNA) foi sintetizado por Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Preparação de PEG-GO-PEI-FA

A síntese de PEG-GO-PEI-FA está de acordo com a estratégia mostrada na Figura S2 (A). Em primeiro lugar, 10 mL de suspensão aquosa GO (1000 μg / mL) foi continuamente sonicada em banho a 50 W por 2 h. Em seguida, 1 mL de EDC · HCL (5000 μg / mL) e NHC (5000 μg / mL) foram adicionados e sonicados intermitentemente por 30 min a 100 W, seguido pela adição de PEG (10 mg) sonicado por 30 min e agitado em um dispositivo magnético agitador durante 6 h a 0 ° C. Para remover os reagentes que não reagiram e obter a solução GO-PEG, a mistura foi dialisada por 24 h em água destilada com uma membrana de diálise (MWCO, 3500 Da). Em seguida, a solução GO-PEG foi sonicada por 30 min, 1 mL EDC · HCL (5000 μg / mL) e NHC (5000 μg / mL) foram adicionados e sonicados por 30 min novamente, seguido pela adição de PEI 25K (5000 μg / mL) ) 2 mL. A mistura foi sonicada durante 30 min e agitada durante 6 h a 0 ° C. Posteriormente, para obtenção do PEG-GO-PEI, a mistura foi dialisada por 24 h em água destilada com membrana de diálise (MWCO, 3500 Da) novamente. A solução PEG-GO-PEI foi sonicada por 60 min, 1 mL EDC · HCL (5000 μg / mL) e NHC (5000 μg / mL) foi adicionado e sonicado por 30 min novamente, seguido pela adição de 10 mg de FA à solução . A solução foi sonicada durante 30 min e agitada durante 12 h a 0 ° C e dialisada durante 48 h para obter PEG-GO-PEI-FA de acordo com o procedimento acima mencionado. A solução dos nanocomplexos foi seca em liofilizador a vácuo (Biosafer-10D).

Caracterização

O potencial zeta de superfície e o tamanho médio de partícula dos nanocomplexos em solução aquosa foram medidos por espalhamento de luz dinâmico (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, Reino Unido). As morfologias dos nanocomplexos foram observadas usando microscópio de força atômica na atmosfera (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Germany). Os espectros de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram adquiridos pelo espectrógrafo Thermo Nicolet 6700 FTIR, usando o pellet KBr na faixa de 400–4000 cm ⁻¹ . Os espectros de absorção de UV-Vis dos nanocomplexos foram medidos por espectrofotômetro de UV-Vis (UV, EV300, EUA). O Raman dos nanocomplexos foi medido por microscópio Raman dispersivo (Senterra R200-L, Alemanha) com comprimento de onda de excitação de 532 nm.

Ensaio de biossegurança in vitro

O SKOV3 (células de câncer de ovário humano) foi adquirido na Keygen (China). As células foram mantidas em meio RPMI-1640, suplementado com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina, 100 g / mL de estreptomicina e cultivadas a 37 ° C sob uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ . Neste estudo, a citotoxicidade dos materiais foi analisada em células SKOV3 pelo ensaio CCK-8. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços na densidade de 6 × 10 ³ células / poço em 100 μL de meio 1640 contendo 10% de FBS e, em seguida, incubado a 37 ° C por 12 h em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ . Em seguida, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA foram adicionados em concentrações finais variando de 10 a 1000 μg / mL e incubados com as células por 12 h adicionais. Outro, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA foram incubados com diferentes tempos de 4 a 24 h nas concentrações de 100 μg / mL. Posteriormente, 10 μL de CCK-8 foram adicionados a cada poço e incubados por mais 3 h a 37 ° C. Em seguida, a absorbância a 450 nm foi medida em um leitor de microplacas. Cada experimento em grupo foi repetido três vezes. A viabilidade celular relativa (%) relacionada às células controle cultivadas em meio foi calculada como (absorbância da amostra - absorbância do branco) / (absorbância do controle - absorbância do branco) × 100%.

Ensaio de retardo em gel de agarose

A solução tampão 20 × TAE foi diluída com água tratada com DEPC para fazer uma solução de agarose a 1%. Em seguida, a solução foi aquecida por 5 min em um forno de micro-ondas para dissolver completamente a agarose. Quando a temperatura da solução de agarose caiu para 55 ° C, solução de brometo de etídio (EB, 0,5 μg / mL) na proporção de volume de 10.000:1 foi adicionada e misturada uniformemente, subsequentemente, a solução de agarose por resfriamento para formar gel de agarose . A mistura de PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA e siRNA em diferentes proporções de peso foram adicionados ao orifício. O gel foi executado a 110 V e 40 mA por cerca de 60 min e, em seguida, observado e analisado por imageador ultravioleta.

Estudos de captação celular de PEG-GO-PEI-FA

Para investigar a captação celular, os nanocomplexos foram marcados com FITC de acordo com o método descrito anteriormente com algumas modificações [28]. Resumidamente, a solução de nanocomplexos (aproximadamente 1 mg / mL, 2,0 mL) foi misturada com 0,2 mL de FITC (26 mM) dissolvido em DMSO e, em seguida, agitada durante a noite à temperatura ambiente. As misturas resultantes foram dialisadas através de membrana de 5000 MWCO para remover FITC não marcado e depois liofilizadas. As células foram semeadas em uma placa de 6 poços (contendo as lamelas) na densidade de 2 × 10 ⁵ células / poço em 2 mL de meio 1640 contendo FBS a 10% e, em seguida, incubado a 37 ° C por 12 h em uma incubadora de cultura de células. Em seguida, o meio em cada poço foi substituído por meio 1640 sem soro. Posteriormente, as células foram tratadas com diferentes nanocomplexos / FITC. As células tratadas sem os nanocomplexos são o grupo de controle, e as células tratadas com PEI 25 K são o grupo de controle paralelo. Após incubação por 4 h a 37 ° C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ , o líquido da placa de cultura foi removido, as células foram lavadas duas vezes com DPBS frio (pH =7,4), em seguida, 20 μL de DAPI e 5 μL de Dil (corante de citomembrana) foram adicionados a cada poço e incubados 20 min a 37 ° C sob o escuro. Posteriormente, o DAPI e Dil do meio de cultura foram removidos e lavados duas vezes com DPBS frio (pH =7,4), e as lamelas das células foram retiradas e fixadas em uma lâmina de vidro com Meio de Montagem Permount TM. Posteriormente, o sinal de fluorescência das lâminas das células foi observado por Microscópio de Varredura a Laser Confocal (CLSM) e analisado a captação celular dos nanocomplexos.

Escape endossomal e penetração no núcleo

Para visualizar a distribuição celular, o escape endossômico e a penetração de nanocomplexos, as células SKOV3 foram semeadas em placas de 12 poços (contendo as lamelas) na densidade de 1 × 10 ⁵ células / poço em 2 mL de meio 1640 contendo 10% de FBS e, em seguida, incubado por 12 h (37 ° C, 5% CO ₂ ) Em seguida, o meio em cada poço foi substituído por meio 1640 sem soro de 1 mL / poço. Posteriormente, os diferentes nanocomplexos (100 μg / mL) marcados por FITC foram adicionados em uma placa de 12 poços para 1 mL / poço. Após 6 h, o líquido foi removido, as células foram lavadas duas vezes com DPBS frio (pH =7,4) e a placa de 12 poços foi adicionado LysoTracker Red (5 μg / mL) para 50 μL / poço. Após incubação por 15 min a 37 ° C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ , o líquido da placa de 12 poços foi removido, as células foram lavadas duas vezes com DPBS frio (pH =7,4), em seguida, 20 μL de DAPI foram adicionados a cada poço e incubados por 20 min a 4 ° C no escuro. Em seguida, o líquido DAPI foi removido e lavado duas vezes com DPBS frio (PH =7,4). Em seguida, com paraformaldeído 4% fixado por 15 min em temperatura ambiente, as lamínulas foram retiradas e fixadas em lâmina de vidro com Meio de Montagem Permount TM. O sinal de fluorescência das lâminas foi observado por microscopia confocal de varredura a laser e analisado o escape lisossomal e a penetração no núcleo dos nanocomplexos [29].

Análise de citoinibição

Analisamos o efeito de inibição celular de PEG-GO-PEI / siRNA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA usando o ensaio CCK-8. Em breve, as células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 6 × 10 ³ células / poço em 100 μL de meio 1640 contendo 10% de FBS e, em seguida, incubado a 37 ° C por 12 h em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO ₂ . Em seguida, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA foram adicionados em concentrações finais variando de 10 a 500 μg / mL e incubados com as células por mais 12 e 24 h. Em seguida, PEG-GO-PEI / siRNA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA foram incubados com células de 4 a 48 h a uma concentração de 100 μg / mL. O siRNA foi transfectado com Lipofectamine 2000 e não tratado como o grupo de controle. Posteriormente, 10 μL de CCK-8 foram adicionados a cada poço e incubados por mais 3 h a 37 ° C. A absorbância foi medida a 450 nm. Cada experimento em grupo foi repetido três vezes. A taxa inibitória (%) foi calculada como 1 - (absorbância da amostra - absorbância do branco) / (absorbância do controle - absorbância do branco) × 100%.

Estatísticas

Cada teste de experimento foi repetido três vezes, e os dados foram analisados ​​usando o software SPSS 17.0. Teste ANOVA unilateral para análise de múltiplos grupos e t de Student não pareado teste para análise de dois grupos foram usados ​​para comparação. Os dados foram expressos como média e desvio padrão (DP), e a significância estatística foi estabelecida em p <0,05.

Resultados e discussão

Síntese de PEG-GO-PEI-FA

A expressão de FR foi primeiramente analisada em diferentes linhagens de células cancerosas com base no banco de dados da Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; http://portals.broadinstitute. Org / ccle) [30] e diferentes tecidos de ovário com base no Gene Expression Profiling Interactive Banco de dados de análise (GEPIA2; http://gepia2.cancer-pku.cn) [31]. Os resultados foram consistentes com pesquisas anteriores (Figura S1). Portanto, escolhemos o FA como um ligante de direcionamento para a entrega do gene.

O óxido de grafeno certamente carrega muitos grupos contendo oxigênio, incluindo carboxilas na borda, hidroxilas e grupos epóxi no plano basal produzido pelo processo de oxidação [32]. Para obter GO em nanoescala (ONG), GO foi continuamente quebrado por sonicação de banho a 50 W por 2 h e, em seguida, seguido por ligação covalente de PEG / PEI / FA a GO usando química EDC / NHS, conforme ilustrado na Figura S2 (A). A Figura S2 (B) mostrou a via de tratamento do PEG-GO-PEI-FA / siRNA. A análise da conjugação química foi realizada pela tecnologia de espectros diferenciais FTIR para obtenção dos picos de absorção espectral [33]. Conforme mostrado na Fig. 1a, a existência de OH (3425 cm ⁻¹ ), C =O (1719 cm ⁻¹ ), e C =H (1350 cm ⁻¹ ) grupos funcionais foram encontrados no GO e indicaram a existência de hidroxila e carboxila na superfície do GO. CH (2885 cm ⁻¹ ) a banda de vibração de alongamento pode ser encontrada quando o PEG reagiu com o GO por meio de ligações covalentes estáveis; isto indicava que PEG tinha sido enxertado em GO e a eficiência de conjugação de PEG era de cerca de 6%. Após PEI e FA reagirem com GO, o NH (1590 cm ⁻¹ ), C – N (1420 cm ⁻¹ ) foi observada banda de vibração de alongamento, indicando que PEI e FA foram enxertados em GO por esterificação. Esses resultados demonstraram que a conjugação PEG-GO-PEI-FA foi sintetizada com sucesso.

A análise sintética bem-sucedida de PEG-GO-PEI-FA usando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e espectrofotômetro UV-Vis. a Os espectros de FTIR de GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA. b Os espectros de absorção de UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA

A Figura 1b mostrou os espectros de absorção de UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA. O GO teve um pico de absorção de 223 nm. O FA teve um pico de absorção de 275 nm. O GO-PEG apresentou uma curva suave, indicando que o PEG se conjugou com o GO e tornou a montanha do GO mais lisa. O PEG-GO-PEI teve um pico de absorção em 219 nm, ilustrando que o PEI foi enxertado na superfície do GO-PEG. O PEG-GO-PEI-FA teve um pico de absorção em 219 nm e 275 nm, revelando que o FA havia enxertado no PEG-GO-PEI. Todos esses resultados demonstraram ainda a síntese bem-sucedida de PEG-GO-PEI-FA.

Caracterização de PEG-GO-PEI-FA

Os dados fornecidos na Tabela 1 mostraram o tamanho de partícula e o potencial zeta dos nanocomplexos. O tamanho de partícula dos nanocomplexos aumentou gradualmente para 218,4 nm, enquanto PEG, PEI e FA enxertaram progressivamente na superfície do GO. O potencial zeta mudou de - 16,5 para + 17,5 mv quando o PEI conectado ao GO, o que facilitou a capacidade de adsorver DNA ou RNA carregados negativamente por meio de interação eletrostática e captação celular. Os potenciais zeta de PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA foram + 14,7 mv e + 14,5 mv, respectivamente. Os potenciais zeta revelaram que PEG-GO-PEI-FA ou PEG-GO-PEI-FA / siRNA eram menores do que PEG-GO-PEI devido à carga negativa de FA e siRNA. Estes indicaram que PEG-GO-PEI-FA / siRNA poderia ser adsorvido à superfície das células pela interação de carga e ser usado por endocitose mediada por receptor na citomembrana [34].

A morfologia da superfície e o tamanho de partícula do nanocarreador também foram medidos por AFM e DLS. Conforme mostrado na Fig. 2a, o GO mostrou uma superfície lisa e estrutura de folha com um tamanho de partícula de 192,1 nm. Após o enxerto de PEG, PEI e FA na superfície de GO, o tamanho de partícula de PEG-GO-PEI-FA aumentou para 216,1 nm, e muitas protuberâncias foram observadas na superfície de PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b ), sugerindo que um grande número de decorações foi imobilizado nas folhas GO. Ao mesmo tempo, a altura do PEG-GO-PEI-FA foi maior do que GO, o que se deve principalmente à fixação do PEG, PEI e FA em ambos os planos da folha GO.

A caracterização do sistema de entrega em nanoescala. Microscopia de força atômica (AFM) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) foram usados ​​para caracterizar a morfologia e as distribuições de tamanho: a GO e b PEG-GO-PEI-FA. Espectros Raman para a análise da superfície de óxido de grafeno gerada de GO, GO-PEG e PEG-GO-PEI c

A espectroscopia Raman é uma das mais comumente usadas para medir a caracterização e as propriedades estruturais de materiais nanocarbonados [35]. Conforme mostrado na Fig. 2c, o espectro Raman de GO mostrou a banda de vibração em 1600 cm ⁻¹ (Banda G) e 1354 cm ⁻¹ (Banda D), e a razão da área de ID / IG foi 1,0385, indicando que a parte SP ² a hibridização de GO foi interrompida e formou-se hidroxila e carboxila. GO-PEG e PEG-GO-PEI mostraram a banda de vibração em 1595 cm ⁻¹ (Banda G) e 1352 cm ⁻¹ (Banda D), e a razão de área de ID / IG foram 0,7737 e 0,5238. A razão de área de ID / IG reduziu gradualmente seguindo a reação de PEG e PEI com o GO; isso indicava que o PEG e o PEI haviam sido enxertados na superfície do GO.

Análise de biossegurança in vitro de diferentes ONGs funcionais

A questão da biossegurança de vetores de genes não virais continua sendo um desafio significativo para as aplicações clínicas. As altas cargas positivas não só trouxeram uma excelente capacidade de condensar e proteger genes, mas também levaram a citotoxicidade severa [36, 37]. Para testar a citotoxicidade de nanocomplexos de siRNA livres, o ensaio CCK-8 foi conduzido com células SKOV3 que foram incubadas por 4, 8, 12 e 24 h com nanocomplexos livres em diferentes concentrações (de 10 a 1000 μg / mL). Conforme mostrado na Figura S3, os nanocomplexos ainda tinham alta viabilidade celular no câncer de ovário a 1000 μg / mL e 24 h. A citotoxicidade de todos os nanocomplexos apresentou uma maneira dependente do tempo e da concentração (viabilidade das células SKOV3:maior ou igual a 84,38% para todos os nanocomplexos em 1000 μg / mL, e maior ou igual a 94,21% para todos os nanocomplexos em 24 h com células SKOV3). Esses resultados sugerem que os nanocomplexos apresentam citotoxicidade desprezível e podem servir como um vetor gênico biocompatível.

A análise de nanocomplexos combinados com siRNA

A captação celular de moléculas de RNA livres é geralmente complicada devido às substanciais cargas negativas que elas carregam [38]. O carregamento das biomoléculas carregadas negativamente por polímeros catiônicos é amplamente adotado para resolver o problema [39]. Neste artigo, o carregamento de siRNA no vetor PEG-GO-PEI-FA foi obtido pela mistura de siRNA e PEG-GO-PEI-FA em solução aquosa. Conforme mostrado na Tabela 1, o potencial zeta de PEG-GO-PEI-FA era de + 14,7 mV, indicando que o siRNA pode ser adsorvido à superfície de PEG-GO-PEI-FA por interação eletrostática. Neste estudo, a capacidade de condensação gênica dos nanocomplexos foi avaliada por eletroforese em gel de agarose [40]. A Figura 3a mostrou que PEG-GO-PEI tinha capacidade de condensação evidente para siRNA a uma razão de peso de 10, enquanto o retardo completo de PEG-GO-PEI-FA da migração de siRNA foi observado quando a razão de peso atingiu 20 (Fig. 3b). Portanto, o PEG-GO-PEI-FA poderia proteger o siRNA da degradação, mas, ao mesmo tempo, precisa de um pouco mais do nanocomplexo para demonstrar uma boa capacidade de ligação. Isso pode estar associado aos potenciais zeta de PEG-GO-PEI-FA que não eram tão altos. Estes resultados indicaram que PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA tinham capacidade de entrega suficiente, especialmente PEG-GO-PEI-FA, que ainda exibiu seu potencial como um vetor válido para a entrega eficiente e segura de genes.

A capacidade de carregamento de siRNA em diferentes proporções de peso. O ensaio de retardo em gel de agarose foi conduzido para avaliar a interação entre siRNA e nanocarrier. a PEG-GO-PEI e b PEG-GO-PEI-FA nas várias razões de peso (materiais / siRNA)

Análise de captação celular

É tão crucial que os portadores possam visar especificamente os tumores para a entrega de genes. A fim de confirmar se o transportador PEG-GO-PEI-FA poderia facilmente entrar nas células, usamos FITC como uma sonda fluorescente para imagem intracelular. Ao mesmo tempo, os núcleos foram corados com DAPI e a citomembrana com Dil. Conforme mostrado na Fig. 4, o grupo de controle e o grupo PEG-GO-PEI não mostraram sinais de fluorescência verde ao redor dos núcleos e da citomembrana. Isso implicou que o PEG-GO-PEI não entrou nas células. O PEI 25K e o PEG-GO-PEI-FA / siRNA apareceram como um sinal de fluorescência verde ao redor do núcleo, o que demonstrou claramente que o PEG-GO-PEI-FA poderia penetrar nas membranas celulares e entrar nas células. Os nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA mostraram a captação celular mais ativa, talvez atribuindo ao FA pode ligar especificamente FR que superexpresso na superfície das células SKOV3. Estes resultados sugeriram que o FA desempenhou um papel crítico na mediação da absorção celular eficiente de nanocomplexos de PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA. Mais importante, a capacidade do FA de se ligar ao seu receptor não foi afetada pela ligação amida covalente, e a endocitose mediada pelo receptor não foi impedida.

Captação celular de diferentes nanocomplexos. Imagens de microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) da captação celular de diferentes nanocomplexos marcados com FITC em células SKOV3 de câncer de ovário humano após incubação por 4 h. Azul, núcleos (marcados com DAPI); vermelho, citomembrana (marcado com Dil); verdes, nanocomplexos (marcados com FITC). As barras de escala representam 100 μm, mas a barra de escala é de 10 μm em uma única célula

Análise de escape lisossomal

Para o sistema de entrega de siRNA, eles devem escapar do endossomo ou lisossoma formado. No entanto, se não, o siRNA irá degradar ou drenar para fora da célula [41,42,43]. Nós avaliamos a capacidade de escape endossomal pela localização intracelular dos nanocomplexos usando CLSM. Uma vez que muitos relatórios demonstraram que o PEI 25K pode favorecer o escape endossomal ou lisossomal pelo "efeito da esponja de prótons" [44], o PEI 25K foi usado como controle. Neste estudo, os nanocomplexos foram marcados com FITC. Em primeiro lugar, estimamos que os nanocomplexos entram no lisossomal pelo sinal amarelo que o sinal fluorescente verde do FITC se sobrepõe ao sinal fluorescente vermelho do Lyto Tracker Red. O PEI 25K apareceu como o sinal amarelo após incubação por 4 h com células e outros materiais apareceu como o sinal amarelo após incubação por 2 h com células, o que implica que os materiais entraram nas células (Fig. 5). Quer os nanocomplexos escapem ou não do lisossomal pelo sinal de ciano brilhante, o sinal fluorescente verde de FITC combina com o sinal fluorescente azul de DAPI. Conforme mostrado na Fig. 5a, o sinal verde foi observado no acúmulo nos núcleos, e havia um sinal ciano brilhante após a incubação de PEI / siRNA por 8 h com células, indicando que PEI / siRNA havia escapado do lisossoma. No entanto, PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA tinham algum sinal verde fraco para penetrar nos núcleos logo em 2 h, e sinal mais verde acumulado nos núcleos junto com o aumento do tempo de incubação. E houve um sinal de ciano brilhante quando o PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA foram incubados por 4 h com células (Fig. 5b, c). Isso indicava que os materiais haviam escapado do lisossoma tão cedo. Em uma palavra, esses resultados mostraram que PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA / siRNA permaneceram uma excelente capacidade de escape endossômico ou lisossomal e podem facilitar de forma eficiente o escape lisossomal e a transfecção de genes in vitro.

Internalização celular e escape lisossomal de PEG-GO-PEI-FA observada por CLSM. Células de câncer de ovário SKOV3 incubadas com a PEI, b PEG-GO-PEI-FA e c PEG-GO-PEI-FA por 0,5, 1, 2, 4 e 8 h. Aqueles em azul foram núcleos corados com DAPI, verdes foram nanocomplexos marcados com FITC e aqueles em vermelho representaram endossomos e fluorescência de lisossoma após a coloração com LysoTracker red. As barras de escala representam 100 μm, mas a barra de escala é de 10 μm em uma única célula

Avaliação da inibição celular do PEG-GO-PEI-FA / siRNA

No caso atual, o efeito terapêutico de PEG-GO-PEI-FA / siRNA foi examinado por ensaio CCK-8 em células SKOV3 in vitro. Conforme mostrado na Fig. 6a, não encontramos uma influência significativa na taxa de sobrevivência das células tumorais em diferentes concentrações (10–100 μg / mL) e diferentes pontos de tempo (12 e 24 h) no PEG-GO-PEI- Grupo FA. Mesmo que a concentração fosse superior a 100 μg / mL, a taxa de sobrevivência das células tumorais ainda era superior a 80%. Portanto, escolhemos 100 μg / mL para o próximo estudo inibitório celular. Citotoxicidade mais fraca foi exibida no grupo PEG-GO-PEI / siRNA e Lipo2000 / siRNA (a taxa de inibição de menos de 20%). Comparado com PEG-GO-PEI / siRNA e Lipo2000 / siRNA, PEG-GO-PEI-FA / siRNA teve um efeito inibitório significativo no crescimento de células tumorais SKOV3. PEG-GO-PEI-FA / siRNA inibiu células SKOV3 de uma maneira dependente do tempo (Fig. 6b). Esses resultados indicaram que PEG-GO-PEI-FA / siRNA teve o melhor efeito de inibição para o incremento de células tumorais e poderíamos usar PEG-GO-PEI-FA como um nanocarreador ideal para entrega de genes.

Citotoxicidade in vitro de PEG-GO-PEI-FA / siRNA em células SKOV3 de câncer de ovário via ensaio CCK-8. a SKOV3 cells were treated with PEG-GO-PEI and PEG-GO-PEI-FA at different concentrations (10–500 μg/mL) at 12 and 24 h to get the optimal dose of nanocarrier. b The cytotoxicity of PEG-GO-PEI-FA/siRNA, PEG-GO-PEI/siRNA, and Lipo2000/siRNA were measured in different time points (4–48 h) at 100 μg/mL. Error bars represent ± SD; * p <0.05 (Student’s t test)

Conclusões

In this study, we successfully synthesized a novel gene delivery system, PEG-GO-PEI-FA. The not cytotoxic by itself and excellent biological compatibility of PEG-GO-PEI-FA guaranteed its prospects as a safe and effective gene delivery vector. PEG-GO-PEI-FA/siRNA nanocomplexes exhibited outstanding physicochemical properties for gene targeting delivery. Moreover, PEG-GO-PEI-FA/siRNA could readily enter SKOV3 ovarian cancer cells and escape from the lysosomes. Cytotoxicity assay demonstrated that PEG-GO-PEI-FA/siRNA had a good inhibition effect on ovarian cancer cells in a time-dependent manner, and it exhibited a higher cytotoxicity effect compared to other groups. On the basis of aforementioned results, PEG-GO-PEI-FA may provide good anticipation as a gene vector for targeted gene delivery and more effective strategy in ovarian carcinoma treatments.

Disponibilidade de dados e materiais

Todos os dados gerados ou analisados ​​durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informações complementares.

Abreviações

AFM:

Microscópio de força atômica

CCK-8:

Cell counting kit8

CCLE:

Cancer cell line encyclopedia

CLSM:

Confocal laser scanning microscope

DAPI:

4′-6-Diamidino-2-phenylindole

DLS:

Espalhamento de luz dinâmico

DMSO:

Dimetilsulfóxido

DPBS:

Dulbecco’s phosphate-buffered saline

EB:

Brometo de etídio

EDC∙HCL:

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride

FA:

Folic acid

FBS:

Soro fetal bovino

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FITR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

FR:

Folate receptor

GEPIA:

Gene expression profiling interactive analysis

GO:

Óxido de grafeno

MWCO:

Molecular weight cutoff

NGO:

Nanoscale graphene oxide

NHS:

N -hydroxysuccinimide

NPs:

Nanopartículas

PBS:

Phosphate-buffered solution

PDI:

Índice de polidispersidade

PEG:

Polietileno glicol

PEI:

Polyethyleneimine

siRNA:

Small interfering RNA

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