Entrega Direcionada de siRNA ao Câncer Ovariano Usando Nanocomplexos de Óxido de Grafeno/PEI Funcionalizados com Folato

Resumo

A terapia gênica está emergindo como método válido para tratamento do câncer ovariano, incluindo RNA de interferência pequeno (siRNA). Embora poderosa, poucos sistemas de entrega gênica eficientes e direcionados dificultam seriamente o desenvolvimento da terapia gênica. Neste estudo, sintetizamos um novo vetor gênico PEG-GO-PEI-FA por funcionalização de óxido de grafeno (GO), no qual o ácido fólico (FA) pode se ligar especificamente ao receptor de folato (FR), superexpresso no câncer ovariano. Caracterizações dos nanocomplexos foram avaliadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS), microscopia de força atômica (AFM) e espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). A capacidade de condensação do siRNA e estabilidade foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose. Eficiência de captação celular e capacidade de escape lisossomal em células de câncer ovariano foram investigadas por microscopia confocal a laser. Além disso, a biossegurança celular do sistema e a inibição da tolerância do siRNA foram avaliadas por ensaio CCK-8. O tamanho dos nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA foi 216,1 ± 2,457 nm, exibindo citotoxicidade leve em células de câncer ovariano. Com alta eficiência de captação, PEG-GO-PEI-FA escapa rapidamente do lisossomo e libera o gene. Além disso, PEG-GO-PEI-FA/siRNA inibe efetivamente o crescimento de células de câncer ovariano. Em geral, PEG-GO-PEI-FA/siRNA pode oferecer estratégia promissora para entrega de siRNA no tratamento de carcinoma ovariano FR-positivo ou tumores semelhantes.

Introdução

O câncer ovariano é a principal causa ginecológica de morte no mundo, geralmente associado a desfechos clínicos ruins devido às dificuldades de diagnóstico e terapia precoces. Infelizmente, agentes quimioterápicos convencionais apresentam limitações inerentes como distribuição inespecífica, baixa biodisponibilidade, rápida depuração sanguínea e baixa solubilidade em ambientes fisiológicos. Nas últimas décadas, a terapia gênica foi investigada como abordagem potencial para tratamento de diversos distúrbios genéticos, incluindo cânceres. No entanto, a falta de um vetor de entrega gênica seguro, altamente eficiente e seletivo dificultou seu avanço para utilidade clínica. Atualmente, existem duas categorias de vetores gênicos: virais e não virais. Embora vetores virais tenham mostrada alta eficiência de transfeção, vários inconvenientes limitam sua aplicação clínica, como reações inflamatórias imunes graves e risco de recombinação com vírus de tipo selvagem. Em contraste, vetores não virais têm ampla capacidade de entrega, baixa imunogenicidade e flexibilidade estrutural, tornando-os excelentes alternativas aos vetores virais. Com o rápido desenvolvimento da nanotecnologia, muitas nanopartículas foram exploradas para uso potencial como vetores de entrega gênica. Aqui, este trabalho projetou um novo vetor não viral PEG-GO-PEI-FA que pode ser entregue eficientemente a tecidos tumorais.

O óxido de grafeno (GO) é derivado do grafite produzido por oxidação em múltiplas etapas, ultrassom e purificação do grafite. A superfície do GO contém grupos epóxi, hidroxila e carboxila. Os grupos funcionais oxigenados em sua superfície conferem ao GO excelente biocompatibilidade, permitindo formação de suspensão estável em água e solventes orgânicos, facilitando modificações químicas e funcionalização. Assim, GO tem sido amplamente usado para terapia fototérmica de câncer, entrega de fármacos e genes, e biossensores. Polietileno glicol (PEG) é material seguro, não tóxico, biodegradável; aprovado pelo FDA como transportador de fármacos hidrofílico. A funcionalização do GO com PEG melhora a estabilidade em condições fisiológicas, estende o tempo de ciclo do nanomaterial GO no corpo e melhora a farmacocinética para melhor direcionamento tumoral. Polietilenimina (PEI) tornou-se padrão ouro de vetores não virais devido à sua alta eficiência de transfeção em várias linhagens celulares. No entanto, PEI mostra citotoxicidade severa e baixa biocompatibilidade, limitando aplicações clínicas. Neste estudo, observamos diminuição significativa da citotoxicidade quando PEI foi enxertado na superfície do GO. Receptor de folato é superexpresso na superfície de várias células cancerígenas, especialmente em células de câncer ovariano antes e após quimioterapia. Para entrega gênica direcionada, moléculas de ácido fólico foram ligadas covalentemente ao GO para direcionar receptores de folato.

No geral, o objetivo principal do presente estudo foi explorar um novo sistema de entrega gênica baseado em GO direcionado para aumentar a utilidade da terapia gênica baseada em siRNA para câncer ovariano. O PEG-GO-PEI-FA carregado positivamente pode ser carregado com siRNA para entrega gênica. Sua síntese bem-sucedida, caracterização, internalização celular eficaz e efeito anticâncer in vitro foram analisados usando várias técnicas. Além disso, a segurança deste sistema também foi avaliada in vitro.

Materiais e Métodos

Materiais

Óxido de grafeno foi obtido da Suzhou Carbon Fung Graphene Technology Co. Ltd. (Suzhou, China). Ácido fólico (FA), N-hidroxissuccinimida (NHS) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) foram adquiridos da Sigma Aldrich Trading Co. Ltd. (Shanghai, China). PEI ramificado 25K, PEG (PM = 2000), agarose e cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC·HCL) foram comprados da Adama Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Solução fosfatada tamponada (PBS), salina fosfatada tamponada de Dulbecco (DPBS) e todos os outros reagentes foram adquiridos da Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Todos os demais reagentes eram de grau analítico. Meio RPMI-1640 (Gibco), soro fetal bovino (FBS) (Gibco), tripsina (Gibco) e tampão TAE 20× foram comprados da Thermo Fisher Scientific Co. Ltd. (China). Kit de contagem celular 8 (CCK-8) foi adquirido da Shanghai Yisheng Biological Co. Ltd. (Shanghai, China). LysoTrackerRed, paraformaldeído 4%, 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e reagentes de transfeção Lipofectamine 2000 foram comprados da Invitrogen Co. Ltd. (China). Sonda de fluorescência Dil (Cat. C1036) foi adquirida da Beyotime Co. Ltd. RNA interferente curto anti-PLK1 (PLK1-homo-581) (siRNA) foi sintetizado pela Shanghai GenePharma Co. Ltd. (Shanghai, China).

Preparação de PEG-GO-PEI-FA

A síntese de PEG-GO-PEI-FA segue a estratégia mostrada na Figura S2 (A). Primeiro, 10 mL de suspensão aquosa de GO (1000 µg/mL) foi sonicada continuamente em banho a 50 W por 2 h. Em seguida, 1 mL de EDC·HCL (5000 µg/mL) e NHS (5000 µg/mL) foram adicionados e sonicados intermitentemente por 30 min a 100 W, seguido pela adição de PEG (10 mg) sonicado por 30 min e agitado em agitador magnético por 6 h a 0 °C. Para remover reagentes não reagidos e obter solução GO-PEG, a mistura foi dialisada por 24 h em água destilada com membrana de diálise (PMCO, 3500 Da). Então, solução GO-PEG foi sonicada por 30 min, 1 mL de EDC·HCL (5000 µg/mL) e NHS (5000 µg/mL) adicionados e sonicados por 30 min novamente, seguido pela adição de PEI 25K (5000 µg/mL) 2 mL. A mistura foi sonicada por 30 min e agitada por 6 h a 0 °C. Subsequentemente, para obter PEG-GO-PEI, a mistura foi dialisada por 24 h em água destilada com membrana de diálise (PMCO, 3500 Da) novamente. A solução PEG-GO-PEI foi sonicada por 60 min, 1 mL de EDC·HCL (5000 µg/mL) e NHS (5000 µg/mL) adicionados e sonicados por 30 min novamente, seguido pela adição de 10 mg FA à solução. A solução foi sonicada por 30 min e agitada por 12 h a 0 °C e dialisada por 48 h para obter PEG-GO-PEI-FA conforme procedimento acima. A solução dos nanocomplexos foi seca por liofilizador a vácuo (Biosafer-10D).

Caracterização

O potencial zeta superficial e tamanho médio de partícula dos nanocomplexos em solução aquosa foram medidos por espalhamento dinâmico de luz (DLS, Malvern Zetasizer Nano ZS, UK). As morfologias dos nanocomplexos foram observadas usando microscópio de força atômica em atmosfera (AFM, MuLtimode Nanoscope IIIa, Alemanha). Espectros de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foram adquiridos por espectrógrafo Thermo Nicolet 6700 FTIR, usando pastilha de KBr na faixa de 400–4000 cm⁻¹. Os espectros de absorção UV-Vis dos nanocomplexos foram medidos por espectrofotômetro UV-Vis (UV, EV300, USA). O Raman dos nanocomplexos foi medido por microscópio Raman dispersivo (Senterra R200-L, Alemanha) com comprimento de onda de excitação a 532 nm.

Ensaio de Biosegurança In Vitro

Células SKOV3 (câncer ovariano humano) foram adquiridas da Keygen (China). Células foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% FBS, 100 U/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina, e cultivadas a 37 °C sob atmosfera umidificada contendo 5% CO₂. Neste estudo, a citotoxicidade dos materiais foi analisada em células SKOV3 por ensaio CCK-8. Brevemente, células foram semeadas em placa de 96 poços na densidade de 6 × 10³ células/poço em 100 µL de meio 1640 contendo 10% FBS e incubadas a 37 °C por 12 h em atmosfera umidificada com 5% CO₂. Então, GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA foram adicionados em concentrações finais variando de 10 a 1000 µg/mL e incubados com as células por 12 h adicionais. Outro grupo: GO, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA incubados com diferentes tempos de 4 a 24 h na concentração 100 µg/mL. Subsequentemente, 10 µL de CCK-8 foi adicionado a cada poço e incubado por mais 3 h a 37 °C. Após isso, a absorbância a 450 nm foi medida em leitor de microplacas. Cada experimento foi repetido três vezes. A viabilidade celular relativa (%) relacionada a células controle cultivadas em meio foi calculada como (absorbância da amostra − absorbância do branco)/(absorbância do controle − absorbância do branco) × 100%.

Ensaio de Retardamento em Gel de Agarose

A solução de tampão TAE 20× foi diluída com água tratada com DEPC para fazer solução de agarose 1%. Então, a solução foi aquecida por 5 min em forno micro-ondas para dissolver completamente a agarose. Quando a temperatura da solução de agarose caiu a 55 °C, solução de brometo de etídio (EB, 0,5 µg/mL) na proporção de volume 10.000:1 foi adicionada e misturada uniformemente, subsequentemente a solução de agarose foi resfriada para formar gel de agarose. A mistura de PEG-GO-PEI, PEG-GO-PEI-FA e siRNA em diferentes razões de peso foram adicionadas aos poços. O gel foi corrido a 110 V e 40 mA por cerca de 60 min, e então observado e analisado por imageador ultravioleta.

Estudos de Captação Celular de PEG-GO-PEI-FA

Para investigar a captação celular, os nanocomplexos foram marcados com FITC conforme método descrito anteriormente com pequena modificação. Brevemente, a solução de nanocomplexos (aproximadamente 1 mg/mL, 2,0 mL) foi misturada com 0,2 mL FITC (26 mM) dissolvido em DMSO e agitada durante a noite à temperatura ambiente. As misturas resultantes foram dialisadas através de membrana PMCO 5000 para remover FITC não marcado e depois liofilizadas. Células foram semeadas em placa de 6 poços (contendo lamínulas) na densidade de 2 × 10⁵ células/poço em 2 mL de meio 1640 contendo 10% FBS e incubadas a 37 °C por 12 h em incubadora de cultura celular. Então, o meio em cada poço foi substituído por meio 1640 livre de soro. Subsequentemente, as células foram tratadas com diferentes nanocomplexos/FITC. Células tratadas sem nanocomplexos são grupo controle, e células tratadas com PEI 25K são grupo controle paralelo. Após incubação por 4 h a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% CO₂, o líquido da placa de cultura foi removido, as células foram lavadas duas vezes com DPBS frio (pH = 7,4), então 20 µL DAPI e 5 µL Dil (corante de citomembrana) foram adicionados a cada poço e incubados 20 min a 37 °C no escuro. Subsequentemente, DAPI e Dil do meio de cultura foram removidos e lavados duas vezes com DPBS frio (pH = 7,4), e as lamínulas das células foram retiradas e fixadas em lâmina de vidro com Permount TM Mounting Medium. Em seguida, o sinal de fluorescência das lâminadas das células foi observado por Microscopia Confocal a Laser (CLSM) e analisada a captação celular dos nanocomplexos.

Escape Endossomal e Penetração no Núcleo

Para visualizar a distribuição celular, escape endossomal e penetração dos nanocomplexos, células SKOV3 foram semeadas em placa de 12 poços (contendo lamínulas) na densidade de 1 × 10⁵ células/poço em 2 mL de meio 1640 contendo 10% FBS e incubadas por 12 h (37 °C, 5% CO₂). Então, o meio em cada poço foi substituído por 1 mL/poço de meio 1640 livre de soro. Subsequentemente, diferentes nanocomplexos (100 µg/mL) marcados com FITC foram adicionados na placa de 12 poços para 1 mL/poço. Após 6 h, o líquido foi removido, células lavadas duas vezes com DPBS frio (pH = 7,4), e a placa de 12 poços recebeu LysoTracker Red (5 µg/mL) para 50 µL/poço. Após incubação por 15 min a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% CO₂, o líquido da placa de 12 poços foi removido, células lavadas duas vezes com DPBS frio (pH = 7,4), então 20 µL de DAPI foi adicionado a cada poço e incubado por 20 min a 4 °C no escuro. Em seguida, o líquido de DAPI foi removido e lavado duas vezes com DPBS frio (pH = 7,4). Após fixação com paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente, as lamínulas foram retiradas e fixadas em lâmina de vidro com Permount TM Mounting Medium. O sinal de fluorescência das lâminas foi observado por microscopia confocal a laser e analisado o escape lisossomal e penetração no núcleo dos nanocomplexos.

Análise de Inibição Citotóxica

Analisamos o efeito de inibição celular de PEG-GO-PEI/siRNA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA usando ensaio CCK-8. Brevemente, células foram semeadas em placa de 96 poços na densidade de 6 × 10³ células/poço em 100 µL de meio 1640 contendo 10% FBS e incubadas a 37 °C por 12 h em atmosfera umidificada com 5% CO₂. Então, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA foram adicionados em concentrações finais variando de 10 a 500 µg/mL e incubados com as células por 12 e 24 h adicionais. Então, PEG-GO-PEI/siRNA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA foram incubados com células de 4 a 48 h na concentração de 100 µg/mL. O siRNA foi transfectado com Lipofectamine 2000 e não tratado como grupo controle. Subsequentemente, 10 µL de CCK-8 foi adicionado a cada poço e incubado por mais 3 h a 37 °C. A absorbância foi medida a 450 nm. Cada experimento foi repetido três vezes. A taxa de inibição (%) foi calculada como 1 − (absorbância da amostra − absorbância do branco)/(absorbância do controle − absorbância do branco) × 100%.

Estatística

Cada teste experimental foi repetido três vezes, e os dados foram analisados usando software SPSS 17.0. Teste ANOVA de uma via para análise de múltiplos grupos e teste t de Student não pareado para análise de dois grupos foram usados para comparação. Os dados foram expressos como média e desvio padrão (DP), e a significância estatística foi definida como p < 0,05.

Resultados e Discussão

Síntese de PEG-GO-PEI-FA

A expressão de FR foi primeiramente analisada em diferentes linhagens de células cancerígenas baseada no banco de dados Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE; https://portals.broadinstitute.org/ccle) e diferentes tecidos de ovário baseados no banco de dados Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA2; https://gepia2.cancer-pku.cn). Os resultados foram consistentes com pesquisas anteriores (Figura S1). Portanto, escolhemos FA como ligante direcionador para entrega gênica.

O óxido de grafeno certamente possui muitos grupos contendo oxigênio incluindo carboxilas nas bordas, hidroxilas e grupos epóxi no plano basal produzidos pelo processo de oxidação. Para obter GO em nanoescala (NGO), GO foi continuamente fragmentado por sonicação em banho a 50 W por 2 h e depois seguido por ligação covalente de PEG/PEI/FA ao GO usando química EDC/NHS, conforme ilustrado na Figura S2(A). A Figura S2(B) mostrou a rota de tratamento do PEG-GO-PEI-FA/siRNA. A análise da conjugação química foi realizada por tecnologia de espectros diferenciais de FTIR para obter picos de absorção espectral. Conforme mostrado na Fig. 1a, a existência de OH (3425 cm⁻¹), C=O (1719 cm⁻¹) e C-H (1350 cm⁻¹) grupos funcionais foram encontrados no GO e indicaram a existência de hidroxila e carboxila na superfície do GO. Banda de vibração de alongamento CH (2885 cm⁻¹) pôde ser encontrada quando PEG reagiu com GO via ligações covalentes estáveis; isso indicou que PEG foi enxertado ao GO, e a eficiência de conjugação de PEG foi cerca de 6%. Após PEI e FA reagirem com GO, bandas de vibração de alongamento NH (1590 cm⁻¹) e C-N (1420 cm⁻¹) foram observadas, indicando que PEI e FA foram enxertados ao GO por esterificação. Esses resultados demonstraram que a conjugação PEG-GO-PEI-FA foi sintetizada com sucesso.

A Figura 1b mostrou os espectros de absorção UV-Vis de GO, FA, GO-PEG, PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA. O GO teve pico de absorção a 223 nm. O FA teve pico de absorção a 275 nm. O GO-PEG mostrou curva suave, indicando que PEG conjugou com GO e tornou a montanha do GO mais suave. O PEG-GO-PEI teve pico de absorção em 219 nm, ilustrando que PEI enxertou na superfície do GO-PEG. O PEG-GO-PEI-FA teve picos de absorção em 219 nm e 275 nm, revelando que FA enxertou ao PEG-GO-PEI. Todos esses resultados demonstraram ainda mais a síntese bem-sucedida de PEG-GO-PEI-FA.

Caracterização de PEG-GO-PEI-FA

Os dados na Tabela 1 mostraram o tamanho de partícula e potencial zeta dos nanocomplexos. O tamanho de partícula dos nanocomplexos aumentou gradualmente para 218,4 nm enquanto PEG, PEI e FA enxertaram progressivamente na superfície do GO. O potencial zeta mudou de -16,5 para +17,5 mV quando PEI conectou ao GO, o que facilitou a capacidade de adsorver DNA ou RNA carregados negativamente via interação eletrostática e captação celular. Os potenciais zeta de PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA foram +14,7 mV e +14,5 mV, respectivamente. Os potenciais zeta revelaram que PEG-GO-PEI-FA ou PEG-GO-PEI-FA/siRNA eram menores que PEG-GO-PEI devido à carga negativa de FA e siRNA. Isso indicou que PEG-GO-PEI-FA/siRNA poderia ser adsorvido à superfície das células pela interação de carga e ser usado por endocitose mediada por receptor na citomembrana.

A morfologia de superfície e tamanho de partícula do nanotransportador também foram medidos por AFM e DLS. Conforme mostrado na Fig. 2a, o GO mostrou superfície lisa e estrutura em folha com tamanho de partícula de 192,1 nm. Após enxertia de PEG, PEI e FA na superfície do GO, o tamanho de partícula de PEG-GO-PEI-FA aumentou para 216,1 nm, e muitas protuberâncias foram observadas na superfície de PEG-GO-PEI-FA (Fig. 2b), sugerindo que grande número de decorações foram imobilizadas nas folhas de GO. Ao mesmo tempo, a altura do PEG-GO-PEI-FA foi maior que a do GO, principalmente devido à fixação de PEG, PEI e FA em ambos os planos da folha de GO.

Espectroscopia Raman é uma das mais usadas para medir caracterização e propriedades estruturais de nanomateriais de carbono. Conforme mostrado na Fig. 2c, o espectro Raman do GO mostrou banda de vibração a 1600 cm⁻¹ (banda G) e 1354 cm⁻¹ (banda D), e a razão de área ID/IG foi 1,0385, indicando que parte da hibridização SP² do GO foi quebrada e formou hidroxila e carboxila. GO-PEG e PEG-GO-PEI mostraram bandas de vibração a 1595 cm⁻¹ (banda G) e 1352 cm⁻¹ (banda D), e as razões de área ID/IG foram 0,7737 e 0,5238. A razão de área ID/IG reduziu gradualmente após reação de PEG e PEI com GO; isso indicou que PEG e PEI enxertaram na superfície do GO.

Análise de Biosegurança In Vitro dos Diferentes NGO Funcionais

A questão de biosegurança de vetores gênicos não virais permaneceu desafio significativo para aplicações clínicas. As altas cargas positivas não só trouxeram excelente capacidade de condensar e proteger genes mas também levaram a citotoxicidade severa. Para testar citotoxicidade de nanocomplexos livres de siRNA, ensaio CCK-8 foi conduzido com células SKOV3 incubadas por 4, 8, 12 e 24 h com nanocomplexos livres em diferentes concentrações (10 a 1000 µg/mL). Conforme mostrado na Figura S3, os nanocomplexos ainda tiveram alta viabilidade celular no câncer ovariano a 1000 µg/mL e 24 h. A citotoxicidade de todos os nanocomplexos exibiu modo dependente de tempo e concentração (viabilidade de células SKOV3: maior ou igual a 84,38% para todos os nanocomplexos a 1000 µg/mL, e maior ou igual a 94,21% para todos os nanocomplexos a 24 h com células SKOV3). Esses resultados sugeriram que os nanocomplexos mostraram citotoxicidade desprezível e poderiam servir como vetor gênico biocompatível.

Análise de Nanocomplexos Combinados com siRNA

A captação celular de moléculas livres de RNA geralmente é difícil devido às cargas negativas substanciais que carregam. Carregamento de biomoléculas carregadas negativamente por polímeros catiônicos é amplamente adotado para resolver o problema. Neste artigo, carregamento de siRNA no vetor PEG-GO-PEI-FA foi alcançado misturando siRNA e PEG-GO-PEI-FA em solução aquosa. Conforme Tabela 1, o potencial zeta de PEG-GO-PEI-FA foi +14,7 mV, indicando que siRNA pode ser adsorvido à superfície de PEG-GO-PEI-FA por interação eletrostática. Neste estudo, a capacidade de condensação gênica dos nanocomplexos foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. A Figura 3a mostrou que PEG-GO-PEI teve evidente capacidade de condensação para siRNA na razão de peso 10, enquanto o retardamento completo da migração de siRNA por PEG-GO-PEI-FA foi observado quando a razão de peso atingiu 20 (Fig. 3b). Assim, PEG-GO-PEI-FA pode proteger siRNA da degradação mas, ao mesmo tempo, precisa de um pouco mais de nanocompósito para demonstrar boa capacidade de ligação. Isso talvez esteja associado aos potenciais zeta de PEG-GO-PEI-FA que não eram tão altos. Esses resultados indicaram que PEG-GO-PEI e PEG-GO-PEI-FA tiveram capacidade de entrega suficiente, especialmente PEG-GO-PEI-FA, que exibiu ainda mais seu potencial como vetor válido para entrega eficiente e segura de genes.

Análise de Captação Celular

É crucial que os transportadores possam direcionar especificamente tumores para entrega gênica. Para confirmar se o transportador PEG-GO-PEI-FA poderia entrar prontamente nas células, usamos FITC como sonda fluorescente para imagem intracelular. Ao mesmo tempo, os núcleos foram corados com DAPI, e a citomembrana com Dil. Conforme mostrado na Fig. 4, o grupo controle e grupo PEG-GO-PEI não mostraram sinais de fluorescência verde ao redor dos núcleos e citomembrana. Implicou que PEG-GO-PEI não entrou nas células. O PEI 25K e PEG-GO-PEI-FA/siRNA apareceram como sinal de fluorescência verde ao redor do núcleo, demonstrando claramente que PEG-GO-PEI-FA pôde penetrar membranas celulares e entrar nas células. Os nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA mostraram a captação celular mais ativa, talvez atribuída ao FA poder ligar especificamente FR superexpresso na superfície de células SKOV3. Esses resultados sugeriram que FA desempenhou papel crítico na mediação da captação celular eficiente de PEG-GO-PEI-FA e nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA/siRNA. Mais importante, a capacidade de FA ligar seu receptor não foi afetada pela ligação amida covalente, e a endocitose mediada por receptor não foi impedida.

Análise de Escape Lisossomal

Para sistema de entrega de siRNA, eles devem escapar do endossomo ou lisossomo formado. Caso contrário, o siRNA degradará ou drenará para fora da célula. Avaliamos a capacidade de escape endossomal pela localização intracelular dos nanocomplexos usando CLSM. Como muitos relatórios demonstraram que PEI 25K pode favorecer escape endossomal ou lisossomal pelo "efeito esponja de prótons", PEI 25K foi usado como controle. Neste estudo, os nanocomplexos foram marcados com FITC. Primeiro, estimamos a entrada dos nanocomplexos no lisossomo pelo sinal amarelo que o sinal fluorescente verde de FITC sobrepõe com o sinal fluorescente vermelho de LysoTracker Red. O PEI 25K apareceu como sinal amarelo após incubação por 4 h com células e outros materiais apareceram como sinal amarelo após incubação por 2 h com células, implicando que os materiais entraram nas células (Fig. 5). Se os nanocomplexos escapam do lisossomo pelo sinal ciano brilhante, o sinal fluorescente verde de FITC combina com o sinal fluorescente azul de DAPI. Conforme mostrado na Fig. 5a, o sinal verde foi observado na acumulação nos núcleos, e houve sinal ciano brilhante após incubação de PEI/siRNA por 8 h com células, indicando que PEI/siRNA escapou do lisossomo. No entanto, PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA tiveram algum sinal verde fraco penetrando os núcleos já às 2 h, e sinal verde mais intenso acumulou nos núcleos junto com aumento do tempo de incubação. E houve sinal ciano brilhante quando PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA foram incubados por 4 h com células (Fig. 5b, c). Isso indicou que os materiais escaparam do lisossomo tão cedo. Em suma, esses resultados mostraram que PEG-GO-PEI-FA e PEG-GO-PEI-FA/siRNA mantiveram excelente capacidade de escape endossomal ou lisossomal e podem facilitar eficientemente escape lisossomal e transfeção gênica in vitro.

Avaliação de Inibição Celular de PEG-GO-PEI-FA/siRNA

No caso atual, o efeito terapêutico de PEG-GO-PEI-FA/siRNA foi examinado por ensaio CCK-8 em células SKOV3 in vitro. Conforme mostrado na Fig. 6a, não encontramos influência significativa na taxa de sobrevivência de células tumorais em diferentes concentrações (10–100 µg/mL) e diferentes pontos de tempo (12 e 24 h) no grupo PEG-GO-PEI-FA. Mesmo com concentração acima de 100 µg/mL, a taxa de sobrevivência de células tumorais ainda foi superior a 80%. Então, escolhemos 100 µg/mL para próximo estudo de inibição celular. Citotoxicidade mais fraca foi exibida nos grupos PEG-GO-PEI/siRNA e Lipo2000/siRNA (taxa de inibição menor que 20%). Comparado com PEG-GO-PEI/siRNA e Lipo2000/siRNA, PEG-GO-PEI-FA/siRNA teve efeito inibitório significativo no crescimento de células tumorais SKOV3. PEG-GO-PEI-FA/siRNA inibiu células SKOV3 de modo dependente de tempo (Fig. 6b). Esses resultados indicaram que PEG-GO-PEI-FA/siRNA teve o melhor efeito de inibição para o incremento de células tumorais e poderíamos usar PEG-GO-PEI-FA como nanotransportador ideal para entrega gênica.

Conclusões

Neste estudo, sintetizamos com sucesso um novo sistema de entrega gênica, PEG-GO-PEI-FA. A não citotoxicidade por si só e excelente compatibilidade biológica de PEG-GO-PEI-FA garantiram suas perspectivas como vetor de entrega gênica seguro e eficaz. Nanocomplexos PEG-GO-PEI-FA/siRNA exibiram propriedades físico-químicas excepcionais para entrega gênica direcionada. Além disso, PEG-GO-PEI-FA/siRNA pôde entrar prontamente em células de câncer ovariano SKOV3 e escapar dos lisossomos. Ensaio de citotoxicidade demonstrou que PEG-GO-PEI-FA/siRNA teve bom efeito de inibição em células de câncer ovariano de modo dependente de tempo, e exibiu efeito citotóxico mais alto comparado a outros grupos. Com base nos resultados acima, PEG-GO-PEI-FA pode fornecer boa expectativa como vetor gênico para entrega gênica direcionada e estratégia mais eficaz no tratamento de carcinoma ovariano.

Disponibilidade de Dados e Materiais

Todos os dados gerados ou analisados durante este estudo estão incluídos neste artigo publicado e seus arquivos de informação suplementar.

Abreviações

AFM:

Microscópio de força atômica

CCK-8:

Kit de Ensaio Colorimétrico de Proliferação Celular

CCLE:

Enciclopédia de Linhagens de Células Cancerígenas

CLSM:

Microscópio confocal a laser

DAPI:

4'-6-Diamidino-2-fenilindol

DLS:

Espalhamento dinâmico de luz

DMSO:

Dimetil sulfóxido

DPBS:

Salina fosfatada tamponada de Dulbecco

EB:

Brometo de etídio

EDC·HCL:

Cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida

FA:

Ácido fólico

FBS:

Soro fetal bovino

FITC:

Isotiocianato de fluoresceína

FTIR:

Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier

FR:

Receptor de folato

GEPIA:

Análise interativa de perfil de expressão gênica

GO:

Óxido de grafeno

MWCO:

Corte de peso molecular

NGO:

Óxido de grafeno em nanoescala

NHS:

N-hidroxissuccinimida

NPs:

Nanopartículas

PBS:

Solução fosfatada tamponada

PDI:

Índice de polidispersidade

PEG:

Polietileno glicol

PEI:

Polietilenimina

siRNA:

RNA de interferência pequeno