Efeitos antimicrobianos e citotóxicos das nanopartículas de prata sintetizadas do extrato de casca de Punica granatum

Resumo

Para enfrentar os desafios crescentes de micróbios resistentes a drogas e incidência de tumor, abordagens estão sendo realizadas para fitosintetizar nanopartículas de metal, particularmente nanopartículas de prata, para obter medidas corretivas. Neste estudo, foi feita uma tentativa de utilizar um importante produto de resíduo biológico, casca de fruta de romã ( Punica granatum ), para sintetizar nanopartículas de prata. As nanopartículas de prata (AgNPs) foram sintetizadas a partir do extrato aquoso de casca de romã. A formação de AgNPs sintetizados foi confirmada através de espectroscopia UV-Vis, difração de raios-X (XRD), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), microscopia eletrônica de varredura (SEM) e espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX), bem como através de a mudança da solução aquosa incolor para uma solução castanha escura. Usando espectroscopia UV-Vis, a solução marrom escuro mostrou um pico de banda de ressonância Plasmon em 378 nm em espectroscopia UV-Vis após reagir por 24, 48 e 72 h. O relatório de XRD revelou que os AgNPs tinham uma estrutura cúbica. O relatório de TEM e SEM mostrou que as nanopartículas estavam igualmente distribuídas na solução, com formato e tamanho esférico variando de 20 a 40 nm e com tamanho médio de partícula de 26,95 nm. A imagem EDX também confirmou a presença de AgNPs. Os AgNPs sintetizados foram encontrados para exibir bons efeitos antimicrobianos em bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, particularmente os patógenos Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27584), Proteus vulgaris (ATCC 8427), Salmonella typhi (ATCC 14028), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Staphylococcus epidermidis (MTCC 3615) e Klebsiella pneumonia. Os efeitos citotóxicos de AgNPs também foram testados contra uma linha de células de câncer de cólon (RKO:ATCC® CRL-2577 ™), e foi observado que as viabilidades foram de 56% e 61% nos dias 3 e 5, respectivamente, com exposição a 12,5 μg de AgNPs. Este método simples, econômico e ecológico sugere que os AgNPs biossintetizados usando extrato de casca de romã podem ser uma solução nova e potente para o desenvolvimento de um medicamento para câncer de cólon que também tenha atividade antibacteriana.

Histórico

Nas últimas décadas, tem havido um crescente número de pesquisas em nanotecnologia, particularmente envolvendo a síntese verde e caracterização de nanopartículas, uma vez que nanopartículas com menos de 100 nm de tamanho são agentes ideais para entrega de drogas e aplicações biomédicas [1]. A síntese de nanopartículas desempenha um papel influente em vários campos, incluindo nanotecnologia, biotecnologia, processamento químico, metodologia física, engenharia de sistemas, motores moleculares, nanocristais e nanobiomateriais [2]. Três métodos de produção de nanopartículas existem hoje - rotas químicas, físicas e “verdes”, com a rota verde envolvendo o emprego de agentes redutores biológicos, incluindo extratos de plantas e filtrados microbianos. Os dois primeiros métodos são frequentemente caros e geram subprodutos tóxicos, mas o método de nanosíntese verde foi reconhecido como um processo barato e ecológico [3,4,5].

Na síntese verde de NPs, constituintes vegetais, incluindo proteínas, enzimas e carboidratos, são usados ​​para formular nanopartículas que podem interagir facilmente com biomoléculas alvo [6]. Esta abordagem para a síntese de nanopartículas de prata pode desempenhar um papel importante em tratamentos futuros para várias formas de câncer ou outras doenças que podem ser controladas por fito-nanotecnologia [7, 8]. Bactérias Gram-negativas, como Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa e Proteus vulgaris e patógenos Gram-positivos, como Staphylococcus aureus e S. epidermidis , são responsáveis ​​pela maioria das infecções adquiridas em hospitais [9]. Na verdade, infecções cirúrgicas, incluindo pneumonia e infecções da corrente sanguínea, também são devidas à presença de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas [10]. A síntese de AgNPs mediada por plantas pode ajudar no desenvolvimento de agentes antibacterianos eficazes contra patógenos microbianos de relevância para a saúde pública. Recentemente, notou-se que AgNPs sintetizados podem ter uma relação sinérgica com o antibiótico levofloxacina, aumentando a atividade antimicrobiana total [11]. Muitos pesquisadores relataram que AgNPs sintetizados contêm propriedades antimicrobianas bem conhecidas contra patógenos Gram-positivos e Gram-negativos, bem como efeitos citotóxicos em diferentes linhas de células cancerosas e normais [12,13,14]. Além disso, os AgNPs são altamente eficientes devido a uma alta relação área-superfície-volume, podem facilmente romper e têm a capacidade de penetrar nas células bacterianas quando comparados aos íons de prata isoladamente [13].

O presente estudo está focado na síntese verde de AgNPs usando o extrato aquoso de Punica granatum descascar e investigar suas propriedades antimicrobianas usando placas de teste e medições de concentração mínima de inibição (CIM) após 24 horas de incubação a 37 ° C. A bactéria Gram-negativa E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27584), P. vulgares (ATCC 8427) e Salmonella typhi (ATCC 14028), bem como as bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus (ATCC 29213), S. epidermidis (MTCC 3615) e K. pneumoniae foram estudados para testar a inibição do crescimento potencial por AgNPs sintetizados. Além disso, os efeitos citotóxicos em uma linha de células de câncer de cólon (RKO:ATCC® CRL-2577 ™) foram testados e mostraram uma taxa de viabilidade celular de 56% no dia 3 e 61% no dia 5 com uma dose de 12,5 μg de AgNPs.

Métodos

Preparação do extrato de casca

Um quilo de frutas de romã saudita ( Punica granatum —Cultivado na região de Taif, no Reino da Arábia Saudita) foi adquirido no supermercado de Riade, na Arábia Saudita. Os frutos foram lavados várias vezes com água da torneira e depois com água bidestilada (DDH ₂ O). Após a lavagem, a casca foi removida com cuidado. A casca da romã foi bem enxaguada com DDH ₂ O para evitar qualquer contaminação da superfície e deixar secar completamente à temperatura ambiente. Finalmente, a casca foi moída em uma fina força. Dez gramas do pó fino foram embebidos em 100 mL de DDH ₂ O por 24 h em temperatura ambiente. A mistura resultante foi filtrada usando papel de filtro Whatman No. 1 para adquirir o extrato aquoso. Todo o processo foi realizado em condições esterilizadas.

Processo de síntese de AgNPs

Nitrato de prata (AgNO ₃ ; 0,1 mM) foi misturado com 250 mL de DDH2O. Em seguida, dez mililitros de extrato de casca de romã aquoso foram adicionados e a solução foi completamente misturada usando uma incubadora com agitação por 5 min. A mistura de reação mudou sua cor de uma solução incolor para uma solução de cor marrom após 24 h, indicando a redução dos íons de prata em nanopartículas de prata. A solução de nanopartículas foi então centrifugada a 15.000 RPM por 15 min, e o processo foi repetido quatro vezes. Finalmente, AgNPs purificados foram coletados, e outros ensaios foram realizados para analisar as características e atividades biológicas dos NPs sintetizados. O excesso de extrato de casca foi armazenado a 4 ° C para análise posterior.

Caracterização dos AgNPs

A redução de íons de prata pelo extrato aquoso de casca de romã foi monitorada usando um espectrofotômetro Perkin Elmer Lambda 950 UV / Vis / NIR 24, 48 e 72 h após o início da reação de 200 a 800 nm e em uma resolução de 1 nm . Os padrões de XRD foram obtidos por um difratômetro de raios-X PANalytical capaz de digitalizar velocidades de 20 a 50 com 2 θ e foram usados ​​para determinar a estrutura cristalina das nanopartículas de prata.

As análises topográficas e de composição de superfície dos AgNPs foram realizadas usando a análise TEM realizada em um JEOL JEM-1230 (JEOL, Tóquio, Japão) e JSM 6380 LA SEM, com uma resolução de 3,0 nm. A análise elementar dos AgNPs foi realizada por espectroscopia de energia dispersiva de raios-X (EDX) usando uma série JED 2200 (Jeol).

Estudos Antibacterianos

Preparação para suspensão bacteriana

Cepas bacterianas E. coli (ATCC 25922), P. aeruginosa (ATCC 27584), P. vulgares (ATCC 8427), S. tifo (ATCC 14028), S. aureus (ATCC 29213), S. epidermidis (MTCC 3615) e K. pneumoniae foram obtidos no Hospital King Khalid, Riyadh, Reino da Arábia Saudita. Uma rápida identificação de células bacterianas foi realizada de acordo com métodos publicados anteriormente [15]. Todas as culturas identificadas foram transferidas para meio ágar e armazenadas a -20 ° C até serem necessárias para o estudo. Nesse ponto, cada cepa bacteriana foi inoculada em ágar nutriente estéril e incubada a 37 ° C por 24 h. A suspensão (10 ⁶ CFU / mL) foi preparado transferindo uma alça de inóculo da cultura incubada de 24 horas para 5 mL de caldo nutriente e incubando-a a 37 ° C por 2 h.

Ensaios Antimicrobianos

Os ensaios de atividade antimicrobiana foram realizados usando um método de difusão em agar bem [16]. Um swab estéril foi umedecido com suspensão bacteriana fresca e espalhado em uma placa de ágar Muller-Hinton sólida e estéril. Os poços foram feitos na placa de ágar usando uma broca de cortiça. Diferentes concentrações (25, 50, 75 e 100 μL) de suspensão de nanopartículas sintetizadas foram derramadas em cada poço consecutivo. Todas as placas foram incubadas a 37 ° C durante 24 h. Uma zona de inibição foi medida (mm) em torno de cada poço em cada placa incubada. Para cada experimento, três repetições foram realizadas [17].

Análise de proliferação celular

O efeito dos AgNPs na proliferação celular foi avaliado usando um ensaio Alamar Blue como descrito anteriormente [12].

Em resumo, 0,005 × 10 ⁶ as células / poço foram semeadas em placas de 96 poços com diferentes concentrações (100–0,3 μg / mL) de AgNPs e incubadas por 2 a 5 dias a 37 ° C. O meio, DMEM, foi suplementado com 4500 mg / L de d-glicose, 4 mM de l-glutamina, 110 mg / L de piruvato de sódio, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 × penicilina-estreptomicina e aminoácidos não essenciais (todos adquiridos da Gibco-Invitrogen, EUA). Os poços de controle foram tratados apenas com meio e a proliferação celular foi medida no dia 3 e no dia 5. Nestes momentos, Alamar Blue (1:10) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 37 ° C por 4 h; a seguir, as placas foram lidas em leitor de microplacas espectrofotométrico (Biotek Synergy 2; Biotek Instruments, EUA) e registrada a unidade de fluorescência relativa (RFU).

Análise de apoptose / necrose celular

Para determinar a apoptose / necrose, as células foram tratadas com AgNPs em diferentes concentrações (25-1,5 μg / mL). No dia 5, as células foram coradas com uma solução de coloração fluorescente dupla (1 μL) contendo 100 μg / mL AO (laranja de acridina) e 100 μg / mL de EtBr (brometo de etídio) (AO / EtBr, Sigma, St. Louis, MO ) As células coradas foram expostas a uma solução de corante AO / EtBr (1:100) por 1 min e observadas usando um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse Ti. Os resultados foram comparados com o controle experimental. AO / EtBr, uma combinação de dois corantes, ajuda a visualizar as células com organização aberrante da cromatina. A captação diferencial de AO / EtBr permite a identificação de células viáveis ​​e não viáveis. Particularmente, o AO foi usado para visualizar o número de células que haviam sofrido apoptose.

Análise estatística

As análises estatísticas e gráficos foram realizados usando o software Microsoft Excel 2010 e GraphPad Prism 6.0 (GraphPad, San Diego, CA, EUA). P os valores foram calculados usando comparações múltiplas ANOVA de uma via. A análise de dados antimicrobianos para diferentes concentrações foi testada com um nível de significância de P <0,05.

Resultados e discussão

Os AgNPs foram sintetizados com sucesso usando o extrato aquoso de casca de romã como fonte de agente redutor. A Figura 1a mostra nitrato de prata 0,1 mM dissolvido em 250 mL de DDH ₂ O para fazer uma solução incolor. Em seguida, 10 mL de extrato de casca aquoso foram adicionados e bem misturados, e a mistura de reação mudou lentamente para uma cor marrom escuro ao longo de 24 h, como pode ser visto na Fig. 1b. A mudança de cor observada durante a síntese de AgNPs foi relatada para reações semelhantes quando vários tipos de extratos de partes de plantas, como folhas, flores, cascas, sementes e frutos, são usados. A mudança de cor foi devido a AgNO ₃ interagindo com fontes vegetais e sendo reduzido de nitrato de prata para prata elementar [18,19,20,21,22].

a 0,1 mM de nitrato de prata. b A cor muda após P. granatum extrato de casca adicionado

A Figura 2 mostra o espectro UV-Vis de AgNPs sintetizados usando extrato aquoso de casca de romã. Conforme mostrado na Fig. 2, a banda de absorbância tem um pico em 378 nm nos tempos de reação de 24, 48 e 72 h com intensidades de 0,96, 1,08 e 1,16, respectivamente. A intensidade aumentou com o tempo, pois a reação teve mais tempo para ocorrer, levando a maiores concentrações de AgNPs. Os dados de ressonância de plasmão de superfície mostraram que concentrações crescentes de AgNPs levaram a picos crescentes de AgNP, coincidindo com quantidades aumentadas de prata reduzida ao longo do tempo. Como AgNO ₃ reagiu para formar AgNPs devido à liberação de elétrons do extrato de romã, uma reação concorrente começou a oxidar os radicais ascorbato. Um espectro de absorção de UV-Vis semelhante foi observado em um estudo diferente que produziu AgNPs a partir do extrato de casca de romã, com um pico de absorbância em 371 nm [23].

Espectros de absorbância de UV-Vis de AgNPs sintetizados em 48 a 72 h em intervalos de tempo

O padrão de XRD de AgNPs sintetizados em verde é mostrado na Fig. 3. Seis picos de difração intensos são observados em 2 θ valores variando de 0 a 90, indicando que poderíamos atribuir os planos 111, 200, 220 e 311 de um cubo de face com um íon Ag central. O espectro de XRD sugere que os AgNPs sintetizados se formaram em uma estrutura cristalina. Este resultado está de acordo com os padrões de XRD publicados anteriormente no banco de dados JCPDS (nº 04-0783). Os picos cristalinos não identificados (*) observados correspondem aos óxidos de prata [24]. Uma imagem TEM de NPs aquosos de casca de romã 0,1 mM é mostrada na Fig. 4. Esta imagem mostrou que as partículas eram de forma esférica com um diâmetro variando de 20 a 40 nm, com o tamanho médio de partícula sendo 26,95 nm. Relatórios semelhantes foram feitos em relação à nanossíntese de NPs usando Actinidia deliciosa extrato de fruta [25]. As observações SEM dos AgNPs sintetizados (Fig. 5) mostram uma distribuição igual das nanopartículas de prata na superfície das células da casca da romã. A partir dessa imagem, foi determinado que as nanopartículas têm formato esférico, com diâmetros variando de 20 a 40 nm, o que é semelhante a um relatório anterior de AgNPs de formato esférico variando de 34 a 50 nm de diâmetro produzidos usando Raphanus sativus Extrato de casca de L. [26].

Padrão de XRD de AgNPs sintetizados de P. granatum extrato de casca

Imagem TEM de AgNPs sintetizados de P. granatum extrato de casca

Imagem SEM de AgNPs sintetizados de P. granatum extrato de casca

Na fitosíntese de nanopartículas de prata utilizando o extrato de casca de romã aqui apresentado, o tamanho das nanopartículas obtidas é bastante promissor para a liberação de fármacos. O tamanho das nanopartículas sendo inferior a 100 nm é relatado para desempenhar um papel no desenvolvimento de sistemas inteligentes, aumentando os valores terapêuticos e de imagem e entrega de drogas a tecidos específicos para fornecer terapia de liberação controlada [27]. O tamanho e a forma das nanopartículas influenciam a biodisponibilidade do fármaco nos tecidos-alvo. Nanopartículas que são de 100 nm são relatadas para exibir 2,5 vezes maior captação em comparação com partículas de diâmetro de 1 μm [28, 29]. O tamanho das nanopartículas desempenha um papel fundamental na função da partícula, como degradação, dinâmica vascular, direcionamento, depuração e mecanismos de absorção [30]. Além disso, a natureza nanocristalina dos AgNPs sintetizados melhora a biodistribuição e a farmacocinética, conforme relatado [31, 32]. A utilização de resíduos biológicos de romã será uma nova abordagem para a utilização de resíduos, conforme relatado anteriormente [33].

Os dados do estudo EDX forneceram uma análise qualitativa e quantitativa dos elementos encontrados nas nanopartículas sintetizadas, conforme mostrado na Fig. 6. O estudo EDX forneceu uma análise elementar do conteúdo dos NPs sintetizados e estimou que os NPs consistiam em 70% Ag por peso. Outros elementos e ligações identificados nos resultados incluíram C-K, O, C-U, Cu e K, cada um correspondendo a uma pequena porcentagem da massa total. O relatório EDX fornece evidências de que a baixa concentração de 0,1 mM AgNO ₃ resultou em um grande número de AgNPs sintetizados. Resultados semelhantes foram relatados para AgNO ₃ 0,3 mM que foi vertido em água destilada por 3 he aquecido a 300 ° C, e por 1, 2 e 3 g de extrato de casca de romã misturado com 30 mL de água destilada e aquecido a 80 ° C [34].

Imagem EDX de AgNPs sintetizados de P. granatum extrato de casca com análise quantitativa

As propriedades antibacterianas dos AgNPs sintetizados com romã foram investigadas usando amostras de 25, 50, 75 e 100 μg / mL contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas por meio do teste de difusão em poço de ágar. Placas de ágar com bactérias Gram-negativas E. coli , S. tifo , e P. aeruginosa e as zonas de inibição são mostradas na Fig. 7a-c. Baixas concentrações de AgNPs sintetizados com romã (25 e 50 μL) mostraram atividade inibitória contra P. aeruginosa e E. coli mas não contra S. typhi. Efeitos antimicrobianos semelhantes de produtos de romã foram relatados anteriormente, onde as inibições mais fortes foram observadas para E. coli , S. aureus , e P. aeruginosa [35,36,37].

Efeitos antimicrobianos e zona de inibição de AgNPs de patógenos Gram-negativos ( a - c )

Efeitos antimicrobianos e zona de inibição de AgNPs de patógenos Gram-positivos ( d - f )

A Figura 8a-c mostra a atividade antimicrobiana de AgNPs sintetizados contra os patógenos Gram-positivos K. pneumoniae , S. aureus , e S. epidermidis . A atividade antimicrobiana foi observada mesmo em baixas concentrações de AgNP (25 e 50 μL) para K. pneumoniae, com zonas de inibição de 9 e 14 nm, respectivamente, e contra S. aureus , com zonas de inibição de 6 e 14 nm, respectivamente. Estudos anteriores também confirmaram a inibição do crescimento de bactérias Gram-positivas tratadas com NPs sintetizados [35,36,37,38]. A atividade antibacteriana avaliada após a exposição a AgNPs sintetizados mostrou zonas de inibição na faixa de 7 a 21 mm. A Figura 9 apresenta os efeitos inibitórios de diferentes concentrações (25 a 100 μL) de P. granatum descascar AgNPs em E. coli , P. aeruginosa , S. tifo , K. pneumoniae , S. aureus , e S. epidermidis . Mesmo em baixas concentrações de AgNPs, uma boa atividade antibacteriana foi observada para todos os micróbios, exceto S. tifo , conforme relatado anteriormente [38].

Para analisar os efeitos citotóxicos de AgNPs, foi utilizada uma linha celular de câncer de cólon (RKO:ATCC® CRL-2577 ™). No dia 3, encontramos uma viabilidade de 56% com um tratamento de 12,5 μg e uma viabilidade de 61% no dia 5. As reduções gerais significativas na proliferação foram observadas em> 12,5 μg (Fig. 10a), e foi consistente em dia 5. Além disso, as imagens coradas com AO / EtBr confirmaram a redução da proliferação visualizando colônias e números de células (Fig. 10b). Curiosamente, pudemos observar células com vacúolos citoplasmáticos perinucleares a 12,5 μg (Fig. 10b, c); este processo pode ser uma rota de degradação em lisossomos no processo de autofagia para aumentar a morte celular programada. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar o efeito do AgNP nas funções de autofagia. Em nosso estudo anterior sobre AgNPs sintetizados usando Pimpinella anisum sementes, também descobrimos que 12 μg de AgNPs eram tóxicos para as células HCT116, aumentando a apoptose ou a necrose [12]. Uma baixa concentração de AgNPs também foi relatada como sendo capaz de induzir a apoptose [39]. Os experimentos atuais com AgNPs sintetizados com Punica granatum o extrato da casca também mostrou 55-62% de toxicidade com 12,5 μg. Além disso, a coloração AO / EtBr revelou uma imagem clara da morte celular programada por autofagia.

Atividade antimicrobiana de AgNPs contra patógenos Gram-negativos e Gram-positivos

Citotoxicidade de AgNPs. a Proliferação celular e análise de viabilidade em células RKO. Comparações múltiplas ANOVA unilateral, *** P <0,0005. b Análise de apoptose / necrose em células RKO. c Células RKO expostas a diferentes doses de AgNPs

Conclusões

O resultado do presente estudo mostrou que o extrato de casca de romã é um bom agente redutor para sintetizar nanopartículas de prata com uma faixa de tamanho de 20-40 nm (tamanho médio, 26,95 nm), um pré-requisito ideal para a entrega eficiente do medicamento e para maior biodisponibilidade a um site de destino. A atividade antibacteriana dos AgNPs sintetizados em organismos testados, mesmo em baixas concentrações de AgNPs (25-100 μL), confirma ainda mais a eficiência antibiótica dos AgNPs sintetizados em verde para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos para tratamento contra Gram-negativos e Gram - patógenos positivos. Além disso, os efeitos citotóxicos observados de AgNPs em linhas de células de câncer de cólon e as reduções na proliferação celular a um nível de dose de> 12,5 μg promovem ainda mais AgNPs como um tratamento de primeira linha para tumores.

Abreviações

EDX:

Espectroscopia de raios-X de dispersão de energia

SEM:

Microscópio eletrônico de varredura

TEM:

Microscopia eletrônica de transmissão

XRD:

Difração de raios X

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